人巨噬细胞分化及鉴定

人巨噬细胞分化及鉴定

人单核细胞获取
1.PBMC分离:
采集外周血于EDTA抗凝采血管中，将血液混匀于无菌50mI管中，PBS1:1稀释血液标本;取干净的50 ml管，淋巴细胞分离液、血液、PBS以1:1:1加入，每管15 ml分离液，用10m移液管，沿管壁缓缓加入上述血液稀释液至45ml刻度处，切忌分离液液面波动;室温500g离心30min，升降速度分别调至2和0。根据血液中各组成成分密度的不同，离心后，50ml管内由上而下依次为淡黄色血浆层，单个核细胞白膜层，透明分离液层，及最下方的红细胞层;用移液管轻轻吸去上层血浆层，并将白膜层转移至新的50ml管中，同时加入PBS至50m，300g离心10min;离心结束后弃上清，弹散管底沉淀，再加入PBS至50ml，300q离心10min;离心结束后弃上清，将细胞沉淀弹散。
2.单核细胞纯化
单核细胞纯化采用美天旎生物提供的单核细胞阳选试剂盒或stemcell提供的单核细胞阳性分离试剂盒，具体分离方案参考相应的说明书。

巨噬细胞诱导分化
人的巨噬细胞包括经典活化型巨噬细胞(Classical activated macrophages,M1)及替代活化型巨噬细胞(Alternatively activated macrophages,M2)，显微镜下观察完成分化的细胞形态，M1细胞贴壁最牢，呈梭形;M2细胞贴壁能力较M1差，圆形或椭圆形;DC细胞不贴壁，成簇生长。
1.用1640完全培养基(1640培养基+10%FBS+双抗)重悬细胞至1*10?/m，加入终浓度为50ng/ml的Human M-CSF，24孔培养板中加入1ml细胞悬液，此后隔天半量换液，诱导分化6-7天，细胞分化成M0;
2.M1方向分化:分化6-7天后，加入100ng/ml的LPS和20ng/ml的HumanIFN-Y，同时需加入Human M-CSF，极化24小时;
3.M2方向分化:分化6-7天后，加入20ng/ml的HumanIL-4或者HumanlL-10，同时需加入Human M-CSF，极化24小时;
4.细胞鉴定:购买相应的流式抗体进行染色鉴定。

细胞分化所需的细胞因子:

参考文献:
1. Zajac E, Schweighofer B, Kupriyanova TA, et al. Angiogenic capacity of M1-and M2-polarized macrophages is determined by the levels of TIMP-1 complexedwith their secreted proMMP-9. Blood. 2013;122:4054-4067.2. 2.Gao CH, Dong HL, Tai L, Gao XM. Lactoferrin-Containing ImmunocomplexesDrive the Conversion ofHuman Macrophages from M2- into M1-like Phenotype.Front lmmunol. 2018;9:37.