涨知识 | qPCR专场七：认识不同荧光定量PCR方法

荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种检测方法。该方法通过在PCR体系中添加荧光基团来记录DNA产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的，并且可以通过数据分析计算出起始模板量，这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。
荧光定量PCR实验因为灵敏度高所以经常是差之毫厘谬以千里，所以在实验过程中，我们需要注意诸多细节，谨慎操作。小伙伴们看到这里就要着急了，我怎样才能做好qPCR实验，拿到实验结果，发表高分文章呢？

 

 

荧光定量PCR其本质是通过荧光探针或荧光DNA结合染料和实时荧光定量PCR仪器对PCR扩增产物进行检测和定量，仪器在PCR热循环的过程中测量荧光。市面上有多种不同类型的荧光定量PCR试剂，这些荧光定量PCR试剂的差别是什么？如何根据自己的实验目标去选择呢？小翌为大家细细道来~

 

图.PCR循环流程

 

 

  染料法与探针法的区别     非特异性荧光标记：染料法    

 

SYBR Green 染料是一种荧光DNA结合染料，能够结合在任何双链DNA中的小沟上。该染料在游离状态下，仅发出微弱的荧光，一旦和双链DNA结合，荧光信号便大大增强。在PCR循环中，每形成一条DNA双链，就有一定数量染料结合上去。随着PCR反应的进行，越来越多的双链DNA形成，荧光强度也随之增强。

 

 

由于SYBR Green 染料会和任意双链DNA结合并发出荧光信号。当反应中出现引物二聚体或者非特异扩增时，便有可能产生明显的假阳性信号。具体的表现是熔解曲线呈现双峰或多峰，扩增曲线中的Ct值相比正常值偏小。

 

  特异性荧光标记：探针法     目前市面上几乎所有的探针法荧光定量PCR都是利用了荧光共振能量转移现象，探针上存在一定对能产生荧光共振能量转移的基团，利用PCR反应中的一些类似酶切、杂交等过程，使两个基团的距离发生变化，使得整个PCR系统中的荧光强度或者荧光种类发生变化，这种变化与PCR产物类型和产物量有直接关系。

 

 

探针法荧光定量有多种类型，例如TaqMan探针法、双杂交探针法、分子信标探针法和蝎形探针法等。其中TaqMan探针是最常见的探针方法，通常是设计一条与扩增产物能互补能互补杂交的探针，在探针的5’端标记报告基团，在探针3’端标记淬灭基团。当探针完整时，报告基团和淬灭基团之间距离很近，由于荧光共振能量转移存在，报告基团在入射光激发下不会发出荧光信号。PCR反应进行时，探针杂交在引物下游的位置，当DNA扩增酶移动到探针位置上时，酶本身5’-3’端的外切酶活性会从5’端切割探针，从而使5’端报告基团和3’端标记淬灭基团分离，当基团之间的距离超过荧光共振能量转移的范围，报告基团在光照射下，就可发出一定的荧光。由于探针是针对目标序列设计，是特异性的，故而荧光的种类和光信号强度能特异性指示目标序列的种类和数量。

 

  染料法VS.探针法    

 

	染料法荧光定量PCR	探针法荧光定量PCR
特异性	中	高
灵敏度	中	高
可重复性	中	高
多重反应	-	可多重
探针/引物设计	引物	探针+引物
实验成本	低	高
应用	特定基因表达差异分析；DNA定量	特定基因表达分析；DNA定量；SNPs基因分析；基因突变检测；产前遗传病检测；传染病早期病原体检测

 

 

  不同应用的染料法荧光定量   进行荧光定量时，靶标均为DNA模板，但是不同来源的DNA，会存在一定的差异。通常进行染料法荧光定量时，选用的最适DNA产物长度为80-300bp。但是当DNA由18-28个核苷酸组成的miRNA反转录得到时，选用正确的荧光定量试剂变得尤为重要。

 

  miRNA的染料法荧光定量检测     miRNA的长度很短，通常约18-28个核苷酸，因此无法采用常见的普通反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂进行miRNA的检测。目前，市面上采用两种方法对miRNA进行反转录，一种是加尾法(加A法)，另一种是茎环法。两种方式均是通过人为加长序列的方式获取第一链cDNA，该cDNA的长度通常在60-80nt左右。
另外不同miRNA之间碱基序列的差异不大，在仅有的18-28个核苷酸内，不同miRNA甚至会出现仅1个核苷酸不同的现象，高效特异性区分不同miRNA也十分重要。因此，常规的荧光定量可能难以满足miRNA实验目标所需，需要选用专门针对短片段扩增，且能高特异性准确定量的荧光定量试剂。

 

 

miRNA的定量检测不仅可以选用染料法荧光定量，也可选用适宜的探针法荧光定量。

 

  常见DNA的染料法荧光定量检测     市面上常见的染料法荧光定量试剂均可满足常见DNA的荧光定量检测，但需要注意的是，由于染料法荧光定量中染料结合任意双链DNA的特性，除需要精心设计引物和进行熔解曲线分析以外，最好选用保证灵敏度和特异性双兼顾的染料法荧光定量试剂，减少因为DNA扩增酶本身特异性原因造成的非特异扩增。

 

 

  不同应用的探针法荧光定量   探针法荧光定量按照检测靶标数量可分为单重荧光定量PCR和多重荧光定量PCR。单重荧光定量PCR相对来说比较简单，即在单个孔中通过一次PCR反应针对一个基因进行扩增检测。而多重荧光定量PCR则是在单孔中通过一次PCR反应同时针对多个靶标进行扩增，利用一定的检测方式实现对多个靶标进行检测。那么，在实际使用时，有什么具体的差别呢？

 

  场景模拟     采用相对定量法分析并确定某个生物体经过药物处理后目的基因的表达情况。采用单重荧光定量PCR试剂，则每个孔中只有一个基因(内参基因或目的基因)扩增，若技术重复为三次，则需要将样品分成6份，3个用于内参基因检测，3个用于目的基因检测，用以检测目的基因的表达情况。而采用多重荧光定量PCR，进行三次技术重复，仅需将样品分成3份，3个孔中通过用一个PCR反应扩增内参基因和目的基因，从而检测目的基因的表达情况。
多重荧光检测，可以通过单个PCR反应中进行多个基因的扩增从而减少qPCR反应所需要的样品量，且该方式和单重荧光定量检测一样灵敏准确。除了节省样本量外，还可节省试剂以及设置实验程序和分析实验结果所需要的时间。单孔扩增多个基因也可最大限度地减少移液误差。
使用多重荧光定量PCR也有需要注意的事项，其中最为重要的是，需要保证不同基因在单重荧光定量反应中和多重荧光定量反应中的结果是一致的。尤其是扩增的基因中同时存在着低丰度表达基因和高丰度表达基因。

 

  两步RT-qPCR与一步RT-qPCR的区别   两步RT-qPCR首先在一管中使用反转录酶将RNA反转录成cDNA，通常选用随机引物、oligo dT或基因特异性引物进行反转录。完成反转录后，吸取约10%左右的cDNA用于后续荧光定量PCR。

 

 

  两步法RT-qPCR的优点      

• cDNA量充足：反转录后产生的cDNA可选择通过稀释或者直接使用的方式满足多次实时荧光定量实验；

• 满足多靶标：通过oligo dT和随机引物，可以从单个RNA样本中扩增多个靶标。

 

  两步法RT-qPCR的缺点      

• 便捷性差：两步反应需要更多的处理，不太适合高通量应用；

• 污染风险：由于每个步骤都需要使用单独的管子，污染的风险增加；

• cDNA产物中残留试剂的抑制：反转录酶和反转录缓冲液残留会一定程度抑制荧光定量PCR，因此在荧光定量PCR中建议仅使用10%的cDNA进行反应。若稀释不当，相关残留组分可能会抑制DNA聚合酶。

 

当起始模板是RNA时，可选用一步RT-qPCR进行定量检测。和常规的两步RT-qPCR不同的是，该方法在同一管封闭状态下，完成了反转录和荧光定量PCR，节省了操作步骤和操作时间，并减少了反复开盖带来的风险。基因特异性引物是必须的，用于反转录和定量扩增。若采用Oligo dT或随机引物将会在一步法中产生非特异性产物并减少目标产物的量。

 

 

  一步法RT-qPCR的优点      

• 减少污染：一管一步式可防止在反转录和荧光定量PCR阶段之间引入污染物；

• 便捷：移液步骤减少，手动操作时间减少；

• 高通量检测：每个样本获得结果的总时间缩短且可重现性高；

• 灵敏度高：所有产生的第一链cDNA都可用于实时PCR扩增，一定程度上提高灵敏度。

 

    一步法RT-qPCR的缺点      

• 二聚体风险增加：上下游基因特异性引物在42℃-50℃下更易发生二聚体聚合，从而导致非特异扩增；

• 检测靶标数少：单一RNA模板能够检测的靶标数量相对较少。

 

以上是对不同荧光定量PCR方法的介绍，相信小伙伴们通过小翌的介绍，对如何选择适合自己的荧光定量PCR方法已经有一定的了解啦。关于如何做好qPCR实验，小翌会陆续在公众号里传授秘籍哒，敬请期待哦。

 

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