实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问构建过表达载体克隆这一步就卡住了怎么办

汤姆卜丽波

你要先明确你的目的片段大小然后选择合适的载体质粒，和内切酶，具体哪一步有问题可以细致的问，实在不行提供基因给公司让公司合成

4 回答553 围观

问为什么做进化树会显示这个做不出来呀

huarenqiang5

考虑可能是网站会将系列变成反向互补的系列。如果我们建树的系列是从Ncbi上下载来的。那么，目的系列最好也从网上下载。或者将提交的系列版相互补一下，再尝试建树试试。

3 回答1852 围观

问同源重组的原理是什么呀同源臂是什么呀？为什么同源重组的酶可以不用考虑目的片段上有没有呀

汤姆卜丽波

同源重组又称一般性重组。同源重组发生在DNA的同源序列之间，通过配对、链的断裂和再连接，而产生片段交换的过程，是最基本的重组方式，同源臂是指两个DNA片段之间的相似性，主要是因为有同源序列，所以不同考虑目的片段

4 回答19516 围观

问pcr的原理是什么呀有可以详细讲解一下的嘛

汤姆卜丽波

在存在DNA模板、引物、dNTPs、适当缓冲液 (Mg2+) 的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的核酸片段进行扩增，这种扩增是以模板DNA与引物之间的变性、退火、延伸三步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。

4 回答947 围观

问各位老瑞氏-吉姆萨染色如果用浸染的方式应该怎么操作呢

汤姆卜丽波

手工步骤是 ①滴加姬姆萨染色液A液（0.5〜0.8ml）于涂片上，并让染液覆盖整个标本涂片染色1分钟；②将姬姆萨染色液B 液滴加于A液上面（滴加之量为A液的2 ~3倍）以洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液充分混合，染色3〜10分钟； ③水洗（冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有沉渣沉淀在标本上）；④干燥，镜检。你要浸染的话可以取一部分AB液出来，这样不怕污染母液

4 回答1518 围观

问请问BDNF与IBA-1荧光共定位做不出来的原因是什么？

huarenqiang5

主要考虑是二者的二抗选择不合理导致。建议重新选择二抗试试。

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问小鼠肺泡灌溪液用瑞氏吉姆萨染色液染一直染不好，染色时间都在试剂说明书基础上做了调整，但细胞胞核颜色总是偏深，有染的好的吗

huarenqiang5

考虑肺泡灌洗液重悬液的细胞浓度过大或有核细胞太过密集或PH偏碱导致。建议不改变浓度可以尝试推片制片，然后分别在低倍镜，高倍镜或者油镜下观察和分类细胞。

4 回答1629 围观

问ELISA测抗体效价阴性空OD值过高，抗体稀释25600倍之前阴性孔和阳性孔OD值均为2左右

汤姆卜丽波

我之前做ELISA也有这种情况，基本都是洗板子的时候污染了阴性或者空白对照孔，你调整一下流程再试试看

4 回答783 围观

问SA-β-gal染色求助

huarenqiang5

SA-β-gal染色不需要在超净台完成，在普通的实验室完成即可。是的，加了固定液后就可以不要求无菌了。可以用烘箱孵育染色。

4 回答1413 围观

问蛋白在14-17KDa,wb一直曝光不出来，请问是为什么

balalaLy

14-17分子量不大，转膜一般没问题，可以从抗体的质量、抗体浓度低、蛋白量低、抗体稀释液、tbst这几个方面找。

3 回答753 围观

问蛋白质电泳的loading buffer中甘油含量会影响分子量结果吗？

汤姆卜丽波

Buffer里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔，一般不会影响结果。

3 回答1757 围观

问敲低过表达

loveliufudan

选择敲低或过表达目标基因的方法可以从以下几个方面考虑:1. 效率和稳定性:慢病毒系统效率高,可得到稳定敲低或过表达细胞株;siRNA敲低 temporary。2. 负责制:病毒系统可能对宿主细胞有影响,需评估安全性。siRNA影响较小。3. 细胞类型:对难转染细胞,病毒系统转导效率较好。siRNA可用于多种细胞。4. 作用方式:siRNA主要下调mRNA水平,对编码蛋白水平影响有延迟;病毒系统可直

3 回答1518 围观

问求助！蛋白大小在7kda左右做WB的转膜电压还有时间应该在多少啊

汤姆卜丽波

一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。小片段的可以用250mA。

3 回答3110 围观

问IOD免疫组化

汤姆卜丽波

没有特别明确的标准，你分离图层后，手动调整，尽量把阳性细胞染色囊括进来就可以了

3 回答1806 围观

问【求助】ELISA检测A549细胞上清炎症因子含量，浓度太低

汤姆卜丽波

这种情况，先要分析一下你的阴性对照设定的是否正确，再一个问题是标准曲线怎么样？标准曲线很好的话，分析零孔的OD值是否也是接近样本孔，如果接近的话，可能你的样本里该指标含量很低或者没有，细胞是接种于 6 孔板，培养至 85% 后，将细胞随机分组

3 回答821 围观

问泛素化连接方式

loveliufudan

1. 直接通过WB比较确定泛素化方式有以下局限性:(1) WB不能明确区分不同连接方式的泛素化。(2) 泛素化不一定导致靶蛋白降解,连接方式不同对蛋白表达量的影响可能不同。(3) 需要抑制蛋白酶体活性,否则被泛素化标记的蛋白可能已被降解。2. IP确定泛素化方式的优势:(1) 可以分离不同连接方式的泛素化蛋白。(2) 明确鉴定泛素化部位和类型。(3) 不依赖于蛋白降解,直接检测标记状态。(4) 结

3 回答914 围观

问PB缓冲液pH可以调到9.6吗？

汤姆卜丽波

可以调的，你们实验室平时用什么调就用什么调，我们一般用氢氧化钠和硫酸

3 回答1443 围观

问蛋白纯化buffer 变浑浊求助

汤姆卜丽波

肯定有影响的，你纯化出来的蛋白跑胶看看大小对不对，有没有杂带，浑浊的就不要用了，下次注意操作时避免污染

3 回答1094 围观

问大鼠脑组织FTO好跑吗？我为什么用超敏显影还需要5分钟？还巨丑无比。求救！！！

汤姆卜丽波

你可以发一下你的条带，如果可以发出来光，只是条带不齐或者背景杂乱那就要适当调整封闭的时间，每次洗涤的时候充分洗涤

3 回答346 围观

问小鼠肠道类器官

Keven轩

这两张图显示的细胞都是细菌污染，重新做吧

3 回答570 围观

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