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实验问答

28,814,211 科研人在看

问高保真酶怎么选择？

大明天桃子

传统的高保真酶例如pyrobest没有什么可说的，保真性一般是普通Taq酶的10倍以内。但传统的高保真酶最大的缺点是扩增能力差，长一点儿的基因很难有效扩增，要摸很多条件，一个字麻烦。最近可以买到的高保真酶选择的机会多一点儿了，有宝生的primer star，还有人提示的Taq plus（这个酶没有详细了解过），上述这两个酶的扩增能力我没有详细了解过，有兴趣的可以去打听一下。最高保真的酶可能要数NE

1 回答6667 围观

问做QPCR需要跑电泳吗？

修玛杨

紫外分光光度计检测的是RNA的浓度及是否有蛋白、酚类（就是在氯仿离心取上清的时候是不是吸到了中间层和下层，已经酒精洗异丙醇是否完全）的污染，而RNA电泳则是检测提取的RNA这个过程中是否有降解，如果是miRNA还好一些，如果是mRNA，一旦你的目的mRNA被降解了（也就是RNA电泳出现了3条以上的条带或者18s，28s不合格），那后续实验也就没有必要了。所以，我认为，要想出一个靠谱的实验，也为了避

2 回答7030 围观

问细胞冻存后复苏后的最佳接种浓度?

fyydnz

好久没做实验了，但把我依稀记得的细胞冻存复苏的心得说一下吧！个人觉得没有统一的规定说一管冻存的细胞可以复苏几瓶。首先得看你当时冻存细胞的状态，数量等，要是“种子”不行的话，你后面再怎么复苏，细胞状态也不会好的！再者当复苏后，当离心去除冻存液之后，用培养基吹打开细胞后，可以用肉眼观察下大概细胞浓度，如果觉得细胞浓度很高，可以适当多接种几瓶，要是浓度很低的话，那就少接种，有个一瓶就够了。第三，接种后

2 回答3655 围观

问已经跑了 35 个循环，条带仍然很弱，要继续加循环吗？

86964109

一般循环可以加到40个的，可能有突变，不过又不用测序

2 回答3647 围观

问ELISA 酶联免疫吸附实验步骤一、四中的抗体是同一个吗？

xinqingruyu

步骤四是洗涤步骤，没有抗体，步骤五有抗体。步骤一的抗体和步骤四的抗体，可以是同一种抗体，也可以是不同种抗体，这样根据具体实验而确定，但是这两种抗体又是有区别的，步骤一的抗体作用是一端吸附于酶标孔，一端吸附待检物质，步骤五是被标记物（如HRP）标记的抗体，作用是放大前面步骤的反应效果，便于测试。

3 回答3628 围观

问质粒提取中的振荡到底该怎么振荡？

臭屁昱

基本上我都是把管子上下颠倒7-8次，不需要太过用力。如果你用qiagen的试剂盒，直到溶液絮状沉淀全部由蓝变白即可。之后在冰上放置15分钟让其分层就可以离心了。有的时候肉眼看不见沉淀未必就没有沉淀，可以在加酒精洗脱的时候移到小管子里高速离心（14000r）2-5分钟也许就可以看见了。

3 回答4861 围观

问W1B与W2 的顺序可以调换么？或者是否可以重复洗涤？

我是金博士

这两个作用是不同的，W1B是洗脱液，W2是去盐液，顺序是不能换的，但我有些同学会出现调换的情况，这个时候就要重新把基因组回收回来，再继续提取。重复洗涤的意义在哪里呢？基本上按试剂盒上的要求操作就足够了，重复洗涤损失更多。没必要。

1 回答1260 围观

问自杀质粒构建的重组质粒转化含有自杀质粒的大肠杆菌，是否会有质粒的相容性问题？

大明天桃子

没有必要再转到含有自杀质粒的细菌中了。你构建的含有同源片段的重组质粒本来就具有自杀质粒的功能，转到没有自杀载体的细菌中，其同样能够进行敲除或失活目的基因。另外，如果你有其他特殊目的，实在要转到含有自杀载体的细菌里的话，那你可在你重建的质粒上添加一个不同的抗性基因，这样就可以通过添加抗生素防止质粒丢失了。还有质粒的不相容性是一个缓慢的过程，一般需要几代或几十代或更长的细菌繁殖周期，你做自杀载体的话肯

1 回答2542 围观

问质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测,琼脂糖凝胶电泳的目的是什么?

我是金博士

针对质粒DNA提取实验，它用来检测DNA是否成功提取。除此之外，还可以用来DNA纯化、验证PCR产物、酶切产物等等。建议先复习下基本知识，这个问题实在太基础了。

1 回答4929 围观

问免疫组化结果如何分析？

买买提奥

（1）阳性着色细胞计数法。在4undefined光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。（2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。（3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评

1 回答4704 围观

问感受态制备过程中，如何将第一次离心后的菌体悬浮？

hellokitty5

有一个诀窍就是离心的速度不能太高，如果用大型的离心机，转速在3 500-4 000 rpm 5-10分钟就可以了，只要你能把菌体离下就可以，不要太长时间，这样你的菌会很松，加上一些CaCl2轻轻弹几下就开了，再慢慢弹，慢慢摇，包你很快做好。这是经验，试试吧。

1 回答3344 围观

问POD做细胞凋亡，DAB显色后，需要用苏木素复染阴性细胞核吗？

wendyk

用苏木精复染一下结果会更加清晰，但要注意复染的时间不要过长，能够看清楚细胞核的轮廓即可，染的过深可能会覆盖你的阳性信号。至于DAB你直接买显色试剂盒即可，中山和博士德都有，直接买来用就可以了。自己配的染色效果可能还不好。

1 回答2657 围观

问蛋白质粉碎

丁香通采购助手

如果要破碎细胞的，现在都是用超声波细胞破碎仪吧

1 回答1070 围观

问如何控制胰酶的使用程度？

我是金博士

你用多大浓度的酶，哪个公司的？均有差异的。要自己摸索，我的细胞0.25%胰酶sigma消化20分钟都没有问题的。

1 回答1631 围观

问四唑盐(MTT)比色实验加液量如何选择？

我是金博士

不需要完全照搬文献和书本的，那都是经验值。实际操作，每个人手感不一样，你觉得加10微升，感觉效果还可以，那就用这个值，最终都是为了实验出结果。另外这个问题真不算啥问题，请认真对待每一次提问机会哦。

1 回答1798 围观

问请问目的 cDNA 克隆的鉴定方法有哪些？

吃不饱的猪

还有探针和免疫学荧光转染，酵母双杂交也可以。

1 回答1113 围观

问不是自己的构建的菌种如何进行质粒扩增？

我是金博士

不清楚你的是啥单位，这种情况我遇到过，当时问别人要的pET22b，给的不是放在菌种里的，因此只能转化到菌株里，获得重组菌，再摇菌，提质粒。另外要注意，你的量少，感受态一定要好，操作要非常小心。一般转个现成质粒，还是比较轻松实现的。祝你好运。

1 回答3550 围观

问如何提取酵母菌的蛋白质？

我是金博士

可以用一步法酵母活性蛋白提取试剂盒。由于酵母有坚硬的细胞壁，传统的提取采用强碱，使得大多数蛋白产生变性，而玻璃珠法蛋白提取会使得玻璃珠对蛋白产生一定的非特异性吸附作用，导致蛋白质的损失，该一步法酵母蛋白提取试剂采用一种温和型的非离子去污试剂在20分钟内从酵母细胞中提取可溶型蛋白，而且大决数蛋白可以保持活性，通过对毕赤酵母的可溶型蛋白提取表明，该方法提取效率要高于传统的玻璃珠法。本试剂盒可以使用20

1 回答5075 围观

问如何选择哪种荧光标记的抗体呢？

snowyca

这个你要根据你们实验室的流式细胞仪所能检测的荧光波长范围决定的。具然后你可以根据这个网站，http://www.gotofcm.com/Web2004V2/techinfoview.asp?id=518，选择你们的机器所能检测的荧光。多个标记染色，要注意：所选的不同荧光，其波长距离要越大越好，否则荧光波长重叠会导致一定的假阴性或假阳性

1 回答2585 围观

问利用加尾法 real-time PCR 方法检测 miRNA，PCR 上游引物设计有什么诀窍和原则吗？

phhcrab

1.不太明白你说的第一种方法，是直接miRNA反转录吗，cDNA跟miRNA一样长吗？因为miRNA片段非常小，PCR检测会比较困难。2.你说的第二个方法可能就是环状引物法，就是反转录的引物带有一个环状结构的，反转录后，环状结构会打开，就相当于是把原来的片段延长了，这样后续PCR就好做了，用SYBR Green或者探针检测都可以。现在这个方法用得很多，很多做miRNA检测服务的公司用的也是这种方

2 回答4320 围观

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