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实验问答

28,816,429 科研人在看

问mg2+浓度是如何影响PCR扩增效率的?

我是金博士

PCR要用到聚合酶，酶的反应需要镁离子催化。

2 回答2834 围观

问Western与RT-PCR的区别？

tao0129

这只是从不同的角度来分析，Western研究的是蛋白表达水平，RT研究的是转录水平，尽管二者都是研究基因表达的。但有一定差别，转录水平不完全等同于蛋白表达，因为它没有考虑到转录后调节的问题。但RT有一个好处，只有有序列就可以做，不象Western必须有抗体。并且RT可以研究同一基因不同亚型的表达，而同一蛋白亚型通常有多种基因型。选择哪一种须根据你的目的而言，能两种都做当然好，但有时候也会出现不相一

2 回答2271 围观

问PCR引物的设计原则是什么？

赵栋2012

1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。2. 引物长度一般在15~30碱基之间。3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。4. 引物3′端要避开密码子的第3位。5. 引物3′端不能选择A，最好选择T。6. 碱基要随机分布。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。8. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。9. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。10

1 回答3551 围观

问western blot 可以同时加两种以上的一抗吗？

tao0129

最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。

1 回答5178 围观

问蛋白电泳中途不给力了怎么办？

tao0129

1. 如果sample 先跑的动，后来就不动了，很可能就是缓冲液的问题，这时候单纯的提高电压是没用的。2. pharmacia 系统跑的时候可以清楚的看到电极丝上面有气泡形成，电压越高气泡越多。有气泡但是sample就是不动，那一定就是缓冲液问题。3. 检查缓冲液的时候，从配胶缓冲液开始查起，有些新同学在配胶的时候可能就是吧浓缩胶缓冲液和分离胶缓冲液弄混了。4. 另外，电泳缓冲液最好是用前现配，尤

1 回答2432 围观

问在 WB 实验中，使用 TBS 和 PBS 的区别？

赵栋2012

选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在pH7.0 以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。

1 回答11237 围观

问Western Blot 那种染色好？各有什么特点？

赵栋2012

zyffzw战友回答：1.阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5 μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。2.胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。3.生物素化灵敏度位于1~3之间

1 回答2206 围观

问引物间形成二聚体怎么办？

我是金博士

1、不能重新设计就试试降低一下引物浓度，调整一下体系如优化镁离子浓度或改变模板量。除此之外，形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化，还有program，退火温度太高，时间太短，延伸时间太短都可能是原因。2、把循环中的退火温度提高，避免二聚体的形成。必要的时候，做两步PCR——退火和延伸都在70或72度进行。3、在设计引物时，在上下游引物的5'端加上序列一样的寡核苷酸尾巴，使得PCR进行到第三个

1 回答3954 围观

问PCR 实验中 dNTP 加过量会有什么影响？

我是金博士

dNTP可以与Mg2+结合，从而降低体系中Mg2+浓度，造成Taq的聚合活性下降。另一方面， dNTP过量，可以增大错误扩增的几率，导致出现非特异扩增产物和smear。

1 回答4010 围观

问Western Blot 中抗体反复冻融会影响结果吗？

赵栋2012

wandrer战友回答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

1 回答4903 围观

问Western Blot 实验如何选膜？PVDF 膜还是 NC 膜？

tao0129

PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。两者都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献。

1 回答1835 围观

问WB 实验跑胶条带怎么变成横竖交错了？

小坏2012

可能的原因：1、样品煮沸十分钟后，要离心（12000rpm；10分钟或者更长时间）2、上样的时候注意不要吸入底部的沉淀；如果是以前处理的样品，再次上样前，也要从新离心。3、上样量太大，可以减半或更少。4、电流过大，尤其是样品通过分离胶的时候，最好不要超过40 mA。<5、电泳缓冲液成分或者浓度有问题。6、配胶的液体有问题，尤其是tris盐酸可能性最大。7. 应该简少蛋白质的量：厚胶50~80

1 回答2493 围观

问蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

赵栋2012

ptglab战友回答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过。

1 回答2549 围观

问培养基配置时候用到的纱布或报纸是否需要干燥处理？

我是金博士

干燥了放冰箱里也湿了吧？一般培养基不需要放进冰箱的，直接放在实验台，培养基灭菌后，从灭菌锅里拿出来，瓶口的纱布是湿的，需要风干。有些平板，倒好，凝固了，第二天马上要用的，可以用封口膜封上，放进冰箱。

1 回答1915 围观

问WB 实验中为什么我的条带会跑得比正常的窄？

赵栋2012

drake015战友回答1. 可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀。2. 是不是有窄有宽？可能与你拔梳子的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3. 可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带

1 回答3207 围观

问PCR 时变性时间 15s 退火时间 15s 是否会对结果产生影响？

丁香通采购小助手

引物与PCR大小无关，基本上引物在20-30 bp。

1 回答2191 围观

问PCR后没有目的核酸条带？

小坏2012

1.看看你用的引物适不适合做cDNA的扩增，不要用扩增DNA的引物扩增cDNA。2. 拿到cDNA后做扩增之前，最好做一个阳性对照，看看你的扩增体系工作如何。3. 当然非常少见了，如果你的扩增体系工作的，就是说你的试剂都work的，那么就要考虑你的仪器是不是工作的，有时候PCR仪永久了不维修会有这种情况发生。

1 回答1283 围观

问DNA 纯度的判断根据 OD260/OD280 的比值判断，在什么范围是最佳？

小坏2012

符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6~1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得，你可以自己算一下OD260/OD280，如果在要求的范围内，说明你的OD320偏高，即可能有有机物污染，比如酒精未充分挥发。纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋

1 回答5562 围观

问WB 实验结果为什么出现了多条带？

tao0129

一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化，所以严格意义上说，内参是必须做的。

1 回答5324 围观

问半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？

tao0129

可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5~3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。

1 回答2868 围观

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