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实验问答

26,709,717 科研人在看

问为何我的 WB 压出的片子整张膜都发光？

我是金博士

1、转膜条件基本可以，一抗与二抗浓度均较高。建议：（1）先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测），用点杂交，用1倍TBS或PBS稀释二抗做不同的梯度，比如1：1000，1：2000，1：4000，稀释好后各取1ul点在NC膜上，RT干燥，加发光液，曝光，确定二抗的合适稀释度。二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉，在你加上ECL的时候会很亮，但是很快就会减弱了，首先要保证二抗的稀释度合适才

8 回答6138 围观

问cDNA 产量的很低是什么原因啊？该怎么办？

tao0129

可能的原因：1.RNA模板质量低。2.对mRNA浓度估计过高。3. 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足。4.同位素磷32过期。5.反应体积过大，不应超过50 μl。

2 回答1458 围观

问某一孔荧光信号特别强是怎么回事？

tao0129

原因：1. 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多。2.试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。3.也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染。

2 回答719 围观

问PCR 检测阳性，酶切无带的克隆，测序是否有结果？

tao0129

这种情况下，最好不要送去测序，最好重新做连接。当然这种情况的出现有一种可能是细菌培养时间过长，导致质粒被甲基化修饰所造成的。此时，你只需重新培养细菌，重新提取质粒即可。但这种情况的出现，还有一种可能是PCR假阳性，尤其是在克隆片段较短时会出现。那么这时，你只能重新做连接。建议：干脆重新做连接还比较放心。注意：你的片段比较小，你酶切后的片段浓度能否在电泳后出现带，这一点你一定要弄清，你必须保证浓度酶

1 回答3550 围观

问在做 PCR 时比较合适的扩增产物片段长度是多少？

赵栋2012

没问题，但要注意保真性，也就是用高保真的酶或者采用分段扩增的办法。如有必要有条件，就测序验证。引物设计与你的目的片断长度似乎关系不大，其序列的特异性则是很重要的。有很多常规提高产物特异性的办法，就不一一列举了如果受到模办的局限，不妨采用巢式PCR之类的办法。

1 回答4779 围观

问荧光定量 PCR 扩增产物能否直接进行琼脂糖凝胶电泳？

赵栋2012

确切的说荧光定量PCR产物跑凝胶看到条带说明你的产物很理想，但看不到条带不能说就没有产物，因为荧光定量PCR反应过程并不是严格意义上的循环扩增过程，因为大部分都没有退火温度。

1 回答6587 围观

问如何估计 RT-PCR 扩增产物的大小？

tao0129

你设计的正、反向引物的起止序列编号之差就是扩增产物的长度，如果一段使用oligo（T）就加上它的长度就可以了。

1 回答3456 围观

问为什么荧光定量 PCR 的扩增产物长度不能太长？

tao0129

你说的这种Real-time PCR应该是通过Taqman探针检测的。Taqman探针为基础的Real-time PCR以引物和探针序列决定反应的特异性，而通过荧光强度判断探针降解程度，从而推断模板量。

1 回答6276 围观

问请问一抗和二抗孵育条件如何比较？

tao0129

1.一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1~2 h，而4度过夜和从冰箱拿出后37℃复温45 min。2. 二抗一般室温或37度30 min~1 h，具体时间需要摸索。

1 回答5997 围观

问PCR 产物电泳为什么都在 marker 最高的条带之上？

tao0129

这表示你的扩增不成功。解决方法：1. 是调整PCR体系的条件啦，看看你的试剂、试验参数有没有问题。2. 如果确信自己的PCR技术没问题的话，换一种引物试试看。如果另一种引物能够扩出来，那就是你的引物有问题啦！

1 回答1569 围观

问PCR 产物是否可以直接连到相应的载体上？

tao0129

1克隆产物应该用载体两端含有的引物进行鉴定。2. PCR产物是否可以直接连接到相应载体，要看你PCR用的什么酶。3.用Taq酶的产物末端自动加A，为黏性末端，可以直接连接；如果是用高保真酶，产物是平末端，必须进行磷酸化或者末端加A才能连接。

1 回答2422 围观

问扩增产物居然有很长的拖尾现象？

tao0129

使用Taqman探针做荧光定量PCR的产物一般都会做的很小，100 bp 多点吧，最大也不超过200 bp 的，你用的退火温度是50度，非特异扩增是不可避免的，即使引物的特异性很好，引物二聚体也肯定存在，而且大小和产物接近，所以在电泳的时候出现脱尾现象很正常。为什么扩增曲线会很好呢？因为使用了Taqman探针，只有特异性扩增产物会产生荧光，把引物二聚体和非特异扩增都屏蔽了，所以扩增曲线会很好！另外

1 回答2565 围观

问PCR 扩增产物如何保存？最多可以保存多久呢？

tao0129

放在-20度应该可以保存一段时间。即使放4度也可以放一段时间。酶切产物也可以放一段时间，如果只是跑胶的话，如果第一次跑的不理想，可以再跑一次。但如果做分子生物学实验，另说。

1 回答7105 围观

问一抗 4℃ 孵育后为什么要进行 37℃ 复温？

赵栋2012

1. 一方面，防止切片从4℃直接放入PBS易脱片。2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4℃和37℃时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

1 回答4207 围观

问免疫组化中的血清封闭原理？

tao0129

封闭血清的原理主要有两点。第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。

1 回答7630 围观

问PCR 扩增产物浓度不够

赵栋2012

对于克隆所需，你可以多扩增几管，然后合并回收/浓缩。提高产物量建议：1. 如果你没有引物二聚体，建议你提高引物浓度试试。2.尽量降低退火温度。3. 鉴定用的话可以增加循环数，克隆的话就没必要了（<35)，循环数增加突变几率也会增加的。4. 如果你觉得模板浓度太高，可以降低浓度的，太高不好，引物正确配对的机会降低。5. 鉴定用可以考虑重新设计引物的，扩增产物长度不必太长200bp左右就行了。6

1 回答4313 围观

问制作下层凝胶后，用异丁醇封闭，可否用其他代替，比如正丁醇或水？

我是金博士

正丁醇、乙醇都是可以的，我们以前就用过。水就不行了。

1 回答918 围观

问通过 PCR 扩增出来的目的基因有粘性末端或平末端吗？

tao0129

常规Taq酶PCR产物3‘端带A，为粘性末端。高保真酶如PFU之类的PCR产物为平端。详见你使用的Taq酶说明。

1 回答2503 围观

问封闭血清的选择原则是什么？

tao0129

1.膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。2.封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。3. 也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

1 回答1978 围观

问PCR 扩增产物于引物区会发生移码突变吗？

tao0129

一般来说测序在最开始的20个碱基是不太会有好的峰型的，但是如果你几次测序都是这个结果，那么就应该是引物合成的问题了。一般生工默认的合成引物会有三种纯化方式，PAGE胶纯化，过柱子和HPLC，三种的价格是PAGE另外，你的酶切位点与突变的位点不在一个位置，所以由于酶切造成的可能性不是很大，但也不能排除这个原因。

1 回答3393 围观

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