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实验问答

25,482,468 科研人在看

问为何我的 WB 压出的片子整张膜都发光？

我是金博士

1、转膜条件基本可以，一抗与二抗浓度均较高。建议：（1）先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测），用点杂交，用1倍TBS或PBS稀释二抗做不同的梯度，比如1：1000，1：2000，1：4000，稀释好后各取1ul点在NC膜上，RT干燥，加发光液，曝光，确定二抗的合适稀释度。二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉，在你加上ECL的时候会很亮，但是很快就会减弱了，首先要保证二抗的稀释度合适才

8 回答6065 围观

问Western与RT-PCR的区别？

tao0129

这只是从不同的角度来分析，Western研究的是蛋白表达水平，RT研究的是转录水平，尽管二者都是研究基因表达的。但有一定差别，转录水平不完全等同于蛋白表达，因为它没有考虑到转录后调节的问题。但RT有一个好处，只有有序列就可以做，不象Western必须有抗体。并且RT可以研究同一基因不同亚型的表达，而同一蛋白亚型通常有多种基因型。选择哪一种须根据你的目的而言，能两种都做当然好，但有时候也会出现不相一

2 回答2195 围观

问某一孔荧光信号特别强是怎么回事？

tao0129

原因：1. 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多。2.试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。3.也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染。

2 回答704 围观

问PCR引物的设计原则是什么？

赵栋2012

1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。2. 引物长度一般在15~30碱基之间。3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。4. 引物3′端要避开密码子的第3位。5. 引物3′端不能选择A，最好选择T。6. 碱基要随机分布。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。8. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。9. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。10

1 回答2578 围观

问固定在玻片上的细胞在保存后能否再用？

tao0129

如需要，可将有固定化细胞的玻片放在70%的乙醇中，-20℃保存2周。

1 回答1320 围观

问为什么会产生弥散（smear）条带？

tao0129

原因：在PCR反应体系中第一链产物的含量过高。解决办法：1.减少引物的用量。2. 优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数。3. 在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

1 回答4846 围观

问PCR 实验的扩增曲线为什么呈现直线型？

tao0129

原因：1.探针部分降解。探针降解原因：（1）探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融。（2）探针在光线下暴露时间太长。2.反应液中有PCR抑制物。

1 回答1569 围观

问PCR 时变性时间 15s 退火时间 15s 是否会对结果产生影响？

丁香通官方号

引物与PCR大小无关，基本上引物在20-30 bp。

1 回答2074 围观

问扩增产物滞留在加样孔中了怎么办？

tao0129

1. 有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。2. 另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

1 回答1509 围观

问请问一抗和二抗孵育条件如何比较？

tao0129

1.一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1~2 h，而4度过夜和从冰箱拿出后37℃复温45 min。2. 二抗一般室温或37度30 min~1 h，具体时间需要摸索。

1 回答5882 围观

问扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅？

tao0129

1.最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系.2. 与反应起始时RNA的总量及纯度有关。3. 建议在试验中加入对照RNA。4.第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10。5. 建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ

1 回答2382 围观

问免疫组化中的血清封闭原理？

tao0129

封闭血清的原理主要有两点。第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。

1 回答7521 围观

问PCR后没有目的核酸条带？

小坏2012

1.看看你用的引物适不适合做cDNA的扩增，不要用扩增DNA的引物扩增cDNA。2. 拿到cDNA后做扩增之前，最好做一个阳性对照，看看你的扩增体系工作如何。3. 当然非常少见了，如果你的扩增体系工作的，就是说你的试剂都work的，那么就要考虑你的仪器是不是工作的，有时候PCR仪永久了不维修会有这种情况发生。

1 回答1226 围观

问为什么要使用基因特异性引物？

tao0129

GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。

1 回答2561 围观

问阴性对照或空白对照翘尾

tao0129

原因：1. 模板提取环境有污染。2. 模板提取操作有污染。3 试剂配制过程存在污染。

1 回答3539 围观

问DNA 纯度的判断根据 OD260/OD280 的比值判断，在什么范围是最佳？

小坏2012

符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6~1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得，你可以自己算一下OD260/OD280，如果在要求的范围内，说明你的OD320偏高，即可能有有机物污染，比如酒精未充分挥发。纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋

1 回答4943 围观

问石蜡切片和冰冻切片的比较？

tao0129

1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。2. 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果

1 回答4290 围观

问封闭血清的选择原则是什么？

tao0129

1.膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。2.封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。3. 也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

1 回答1945 围观

问WB 实验结果为什么出现了多条带？

tao0129

一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化，所以严格意义上说，内参是必须做的。

1 回答5247 围观

问半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？

tao0129

可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5~3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。

1 回答2654 围观

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