实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问高保真酶怎么选择？

大明天桃子

传统的高保真酶例如pyrobest没有什么可说的，保真性一般是普通Taq酶的10倍以内。但传统的高保真酶最大的缺点是扩增能力差，长一点儿的基因很难有效扩增，要摸很多条件，一个字麻烦。最近可以买到的高保真酶选择的机会多一点儿了，有宝生的primer star，还有人提示的Taq plus（这个酶没有详细了解过），上述这两个酶的扩增能力我没有详细了解过，有兴趣的可以去打听一下。最高保真的酶可能要数NE

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问细胞冻存后复苏后的最佳接种浓度?

fyydnz

好久没做实验了，但把我依稀记得的细胞冻存复苏的心得说一下吧！个人觉得没有统一的规定说一管冻存的细胞可以复苏几瓶。首先得看你当时冻存细胞的状态，数量等，要是“种子”不行的话，你后面再怎么复苏，细胞状态也不会好的！再者当复苏后，当离心去除冻存液之后，用培养基吹打开细胞后，可以用肉眼观察下大概细胞浓度，如果觉得细胞浓度很高，可以适当多接种几瓶，要是浓度很低的话，那就少接种，有个一瓶就够了。第三，接种后

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问已经跑了 35 个循环，条带仍然很弱，要继续加循环吗？

86964109

一般循环可以加到40个的，可能有突变，不过又不用测序

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问细胞凋亡检测试剂怎么选择呢？

我是金博士

细胞凋亡检测试剂已经是常规试剂了，选择没那么复杂。国产的多是买的国外的自己进行分装，实验试剂这东西，经费少的话可以试试国产，经费足或者对结果要求高建议还是就直接用国外的好。如果你仅仅是一般地细胞凋亡，可以用Annexin V-FITC&PI，这个凯基公司有的，我用过。好像是20T，5-600RMB。如果你还涉及到了细胞内本身表达报告基因,诸如(E)GFP之类的，你可以买BD公司的Annex

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问ELISA 酶联免疫吸附实验步骤一、四中的抗体是同一个吗？

xinqingruyu

步骤四是洗涤步骤，没有抗体，步骤五有抗体。步骤一的抗体和步骤四的抗体，可以是同一种抗体，也可以是不同种抗体，这样根据具体实验而确定，但是这两种抗体又是有区别的，步骤一的抗体作用是一端吸附于酶标孔，一端吸附待检物质，步骤五是被标记物（如HRP）标记的抗体，作用是放大前面步骤的反应效果，便于测试。

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问质粒提取中的振荡到底该怎么振荡？

臭屁昱

基本上我都是把管子上下颠倒7-8次，不需要太过用力。如果你用qiagen的试剂盒，直到溶液絮状沉淀全部由蓝变白即可。之后在冰上放置15分钟让其分层就可以离心了。有的时候肉眼看不见沉淀未必就没有沉淀，可以在加酒精洗脱的时候移到小管子里高速离心（14000r）2-5分钟也许就可以看见了。

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问W1B与W2 的顺序可以调换么？或者是否可以重复洗涤？

我是金博士

这两个作用是不同的，W1B是洗脱液，W2是去盐液，顺序是不能换的，但我有些同学会出现调换的情况，这个时候就要重新把基因组回收回来，再继续提取。重复洗涤的意义在哪里呢？基本上按试剂盒上的要求操作就足够了，重复洗涤损失更多。没必要。

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问自杀质粒构建的重组质粒转化含有自杀质粒的大肠杆菌，是否会有质粒的相容性问题？

大明天桃子

没有必要再转到含有自杀质粒的细菌中了。你构建的含有同源片段的重组质粒本来就具有自杀质粒的功能，转到没有自杀载体的细菌中，其同样能够进行敲除或失活目的基因。另外，如果你有其他特殊目的，实在要转到含有自杀载体的细菌里的话，那你可在你重建的质粒上添加一个不同的抗性基因，这样就可以通过添加抗生素防止质粒丢失了。还有质粒的不相容性是一个缓慢的过程，一般需要几代或几十代或更长的细菌繁殖周期，你做自杀载体的话肯

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问质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测,琼脂糖凝胶电泳的目的是什么?

我是金博士

针对质粒DNA提取实验，它用来检测DNA是否成功提取。除此之外，还可以用来DNA纯化、验证PCR产物、酶切产物等等。建议先复习下基本知识，这个问题实在太基础了。

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问细胞传代消化时间过长，消化不下来，这样会对细胞有损害吗？

zyj0630

消化时间过长对细胞的呼吸酶和膜蛋白有损害作用，可以通过拍打细胞培养瓶的物理手段来缩短消化时间。但是个人认为你描述的情况，即本来这种细胞消化时间没那么长，培养时间过长再传代时消化时间变长，这个细胞的有些性质可能已经发生变化了……后续实验中使用不是很好。

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问在各个序列相上呈现什么样的密度可以考虑为脊髓瘤呢？

我是金博士

1、脊索瘤的诊断特征：有不规则肿块，形态欠规整。在T1 加权图像上呈低信号，在T2加权图像上呈不均匀高信号。2、脊索瘤可以与鼻咽癌、脑膜瘤、颅咽管瘤以及软骨瘤鉴别。鼻咽癌起源于咽隐窝，信号强度较均匀，很少有钙化，有显著异常对比增强。颅中窝底脑膜瘤很少引起邻近骨的广泛破坏，T2WI 图像呈等信号甚至低信号，具有十分明显的异常对比增强。颅咽管瘤在T1WI 与T2WI 图像信号强度变化幅度大，增强较少见

1 回答931 围观

问免疫组化结果如何分析？

买买提奥

（1）阳性着色细胞计数法。在4undefined光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。（2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。（3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评

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问感受态制备过程中，如何将第一次离心后的菌体悬浮？

hellokitty5

有一个诀窍就是离心的速度不能太高，如果用大型的离心机，转速在3 500-4 000 rpm 5-10分钟就可以了，只要你能把菌体离下就可以，不要太长时间，这样你的菌会很松，加上一些CaCl2轻轻弹几下就开了，再慢慢弹，慢慢摇，包你很快做好。这是经验，试试吧。

1 回答2845 围观

问POD做细胞凋亡，DAB显色后，需要用苏木素复染阴性细胞核吗？

wendyk

用苏木精复染一下结果会更加清晰，但要注意复染的时间不要过长，能够看清楚细胞核的轮廓即可，染的过深可能会覆盖你的阳性信号。至于DAB你直接买显色试剂盒即可，中山和博士德都有，直接买来用就可以了。自己配的染色效果可能还不好。

1 回答2303 围观

问大肠杆菌转化子有大有小，结果诡异，有何原因？

我是金博士

这情况我遇到过，尤其菌液PCR时候，有的强有的弱，有的带大小还不一样。我没有具体研究过啥愿意，但把大小一样的那个送去测序，一般都是正确的。关于你的这个情况，我分析【我自己的我也分析过】1、可能酶产物碎了一些，这样连进去就有大有小。如果你引物用的是在载体上的，那很可能扩出大小不同的。如果你引物就是在基因上的，这个好解决，你把退火温度逐渐提高，看看是不是那个不同片段就没了。2、有的时候发生了片段自连【

1 回答6101 围观

问如何控制胰酶的使用程度？

我是金博士

你用多大浓度的酶，哪个公司的？均有差异的。要自己摸索，我的细胞0.25%胰酶sigma消化20分钟都没有问题的。

1 回答1352 围观

问四唑盐(MTT)比色实验加液量如何选择？

我是金博士

不需要完全照搬文献和书本的，那都是经验值。实际操作，每个人手感不一样，你觉得加10微升，感觉效果还可以，那就用这个值，最终都是为了实验出结果。另外这个问题真不算啥问题，请认真对待每一次提问机会哦。

1 回答1542 围观

问不是自己的构建的菌种如何进行质粒扩增？

我是金博士

不清楚你的是啥单位，这种情况我遇到过，当时问别人要的pET22b，给的不是放在菌种里的，因此只能转化到菌株里，获得重组菌，再摇菌，提质粒。另外要注意，你的量少，感受态一定要好，操作要非常小心。一般转个现成质粒，还是比较轻松实现的。祝你好运。

1 回答3292 围观

问如何选择哪种荧光标记的抗体呢？

snowyca

这个你要根据你们实验室的流式细胞仪所能检测的荧光波长范围决定的。具然后你可以根据这个网站，http://www.gotofcm.com/Web2004V2/techinfoview.asp?id=518，选择你们的机器所能检测的荧光。多个标记染色，要注意：所选的不同荧光，其波长距离要越大越好，否则荧光波长重叠会导致一定的假阴性或假阳性

1 回答2274 围观

问克隆时发生突变了怎么办？

zhongmindai

回复突变可以用定点突变（site-directed mutation） PCR，但是周期也不会短。克隆的片段不长的情况下，多挑几个去测序，里面肯定会有对的。尽量选用具有更高保真性的酶扩增。

1 回答2465 围观

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