TUNEL 实验中几个关键步骤是什么？

1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20 min，再用二甲苯两次5~10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀。2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30 min，几μm切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2 h，但要结合你最终的背景着色。4.DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30 min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。5.PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。6.此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多