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实验问答

27,503,647 科研人在看

问如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？

丁香实验

产生原因：（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分

1 回答539 围观

问组织免疫荧光染色必需用Triton吗

丁香实验

用丙酮固定细胞或是冰冻切片可以不许要破膜。丙酮本身就有改变细胞通透性和使蛋白沉淀的作用。——要看你做的蛋白存在于胞内还是胞外。胞外，一般是胞膜上的，可以不用Triton。胞内的，包括胞质内，胞核内的，那就得用了，不用的话，染到的阳性细胞只是其中的一部分。

1 回答900 围观

问花板无梯度背景高是怎么回事？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中的孔有颜色但没有梯度，背景也可能较高，。出现该现象的可能原因：底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存，实验前溶液已经变蓝。孵育温度过高或者孵育时间过长，发生了较强的非特异性吸附。没有按说明书要求洗板，特别是洗板时洗涤液的量少加了。加样时没有换枪头造成交叉污染。花板现象：低浓度或者低活性的包被抗体或者检测抗体，封闭不足导致的本底不稳定，洗板不充分，包被

1 回答313 围观

问出现白板现象是怎么回事？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中所有孔的颜色均为无色，即无信号呈现。出现该现象的可能原因：试剂已过保质期，不同批次稀释液交叉使用。错加漏加检测A，检测B或者底物溶液TMB。洗板或者加样过程中，酶标记物被污染失活，稀释液中含有酶抑制剂如叠氮呐等。配置稀释液的蒸馏水可能被污染。洗涤液是浓缩型的，没有按比例进行稀释。酶标记物的活性和效价比较低。溶液的PH值不正确，一般稀释液的PH值应

1 回答422 围观

问研究人血清中的一个蛋白，目前正在制备单抗。请问在用Elisa检测的时候用什么做标准品好？如果就用合成的重组蛋白是否合适？

丁香实验

首先回答你标准品这个，既然称之为标准品那么就可以作为标准的物质，那么就一定具有一定的溯源性。就实际情况来讲你用重组和天然的都可以，因为这两种在商品化Elisa试剂盒中都有使用。那么基于你这个问题再深入聊聊。首先我们分为两类：一是你想做个Elisa检测仅仅用于你项目或者论文的一部分；二是你是准备做商业化产品。第一种情况，你只需要大致做做，用重组就可以。不用深究；第二种情况，这种情况要求你论证更充分。

1 回答326 围观

问ELISA检测时，如何排除其他抗体干扰？

丁香实验

就问题来讲我我认为是这样的体内的Ig的不同形式其实是存在在免疫的不同时期的，或者我们理解为半衰期不同。那么最后起到作用主要还是IgA，其他的都比较少。那么你想排除干扰，这个一般是在你产品的检测系统上下功夫。比如你二抗的特异性等。纯粹去除的，并且简单可行的我没遇见过。

1 回答577 围观

问切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？

丁香实验

a.也许是抗体本身有问题，因为有很多公司的抗体质量并不好，很容易上背景，可以换一种抗体试试。b.如果经费不允许换抗体的话，你可降低抗体的浓度，并随时注意观察显色，在能看到信号的情况下尽量降低背景。c.可以换一种封闭液，不同的封闭液对某种来源的抗体来说，会有不同的封闭效果。d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所检测动物组织的正常血清，这样可以去除一部分非特异性染色。

1 回答690 围观

问免疫组化结果老是出现阴性结果？

丁香实验

免疫组化出现阴性结果有可能组织本身就没有信号，也有可能是抗体出了问题。你可以找一些阳性组织做一下，以确定是抗体的问题还是组织本身就没有所检测的抗原表达。还有，你可以提高抗体的浓度，或者试一试抗原修复等方法，也许会得到意想不到的结果。

1 回答764 围观

问内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

丁香实验

（1）一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min。（2）用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片.（3）现用现配，配好后4度避光保存。

1 回答751 围观

问在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？

丁香实验

（1）由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。（2）修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修复，我们一般用6miundefined4次，效果不错。

1 回答1220 围观

问DAB显色时间如何把握？

丁香实验

（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能

1 回答1482 围观

问流式中检测细胞表面和细胞内蛋白表达水平的抗体有何区别？

丁香实验

1 回答667 围观

问流式细胞仪检测细胞周期是否需要鸡红细胞作参照？

丁香实验

不用，标准微球做完laser alignment（光路校正）就可以了。尽量把微球的各色CV值控制在1.5以内。

1 回答563 围观

问流式与werstern的区别？

丁香实验

（1）Western 是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白，虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白，但对于分泌蛋白却是无能为力的；（2）Western测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般1：1000左右，而流式对抗体的需要量很大，一般1：50（很浪费抗体）；（3）采用Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参，

1 回答1085 围观

问流式中检测细胞表面和细胞内蛋白表达水平的抗体有何区别？

丁香实验

抗体只是针对相应抗原的，至于是针对胞内还是胞膜对你检测来说并无明显影响，你只需要查清楚到底是针对哪一个部位的抗原的，应该是可以用同一种抗体进行检测的，在流式操作时只需注意：如果是针对胞内，则需要加破膜剂，让抗体能和相应抗原接触，否则就不需要了。

1 回答451 围观

问流式同型对照怎样选择？

丁香实验

同型对照：是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与

2 回答975 围观

问请问50xPIC是什么呀？

1 回答2205 围观

问为什么 IP 样品条带位置总和 Input 条带位置不一致？

1 回答6399 围观

问CRISPR 构建点突变细胞系是杂合突变好还是纯合好？

dxy_g1lhlo40

这个不用纠结，你构建细胞系的时候，杂合子和纯合突变单克隆都是有一定概率能获得的，到时候你做实验的时候都保留，进行对比。这样实验数据就更有说服性

1 回答5186 围观

问细胞污染

raulw2003

大家都说了很多方法了，我记得去以前带的师妹做细胞老是污染，后来我看她操作的时候发现她的手上戴了手链，去掉手链后就没有再污染了。你可以注意一下。

29 回答12996 围观

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