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实验问答

28,900,147 科研人在看

问wb 小白求助 E-cadherin 和 N-cadherin 转膜条件和分子量是多少？

丁香实验

E-cadherin是135，一抗的话我们是4℃。转膜的话，我们是恒流，300mA，90min左右

1 回答1409 围观

问染色体免疫共沉淀实验求助，那个proteinA/G是怎么回事？

丁香实验

别买磁珠需要相应的仪器来做磁珠肯定方便些的还有就是珠子不容易吸走背景好点噪音小不过细心点用普通的beads 离心也就可以了

2 回答730 围观

问【求助】PCR实验目的基因的CT值和内参的CT值接近

冰雪芙儿

CT值高，提高模板浓度就行了，我最近也在做，刚开始稀释发现CT值很高，不稀释就好了

2 回答1709 围观

问PCR 结果

午后的红太狼

感觉是因为你提出来的RNA量太少的缘故，从你的内参的CT值可以看出来，可能你要检测的基因本来表达量就不高，内参的CT值不够低的时候，你的目的条带就扩不出来了，大概的看了一下，目的基因有值的那几个，基本都是内参测得比较低的几个，所以建议RNA多提一点，多逆一点，把内参的CT值降到20以下就差不多了

1 回答2430 围观

问【求助】PCR 产物在加样孔里跑不出来怎么回事

xuyongbin

我也曾经遇到这种情况，后来把产物稀释100倍还有，最后我把产物稀释1000倍。取0.5ul，把退火在温度在原来基础上提高2℃就好了，可能是模板量太大的原因。

1 回答1713 围观

问PCR产物电泳条带

sakeiiii

会不会是模板有问题，RNA跑胶了吗？后面这个应该是二聚体或者非特异性扩增？也可能引物有问题

1 回答391 围观

问PCR的CQ值很大?

杨楠520

降低退火温度试试，我降了就可以了

1 回答328 围观

问PCR扩增不出DNA？

我的头痛不再痛

1、其实产物和marker比起来大小上有点偏差是很正常的，包括蛋白在内的分子标量，有时候不是那么准确，这个不必担心，只要差别不是很大就可以。完全可以通过测序去验证。2、之前能扩增出来，后来就扩增不出来，相同的扩增条件和体系，那是否就是模板的问题呢？比如你使用了新的模板，这样就有可能是你模板的质量或浓度问题。

2 回答768 围观

问显色弱灵敏度低？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。出现该现象的可能原因：产品过有效期，试剂没有按规定进行适当的保存。试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。孵育时间和孵育温度未达到实验要求。洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过多，洗板冲击力过大，洗板浸泡时间过长。底物溶液TM

1 回答572 围观

问冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？

丁香实验

1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用

1 回答886 围观

问一抗孵育的条件和浓度如何摸索？

丁香实验

1、孵育条件选择：根据大量外文文献参考，4度过夜的最多，37度或直接室温的较少。故可以按照4度过夜+室温或37度复温（增进抗体抗原结合和防止脱片）。2、组织切片的选择：仅选择某一组同一只动物标本，这样才有可比性，且最好是预想肯定阳性的组别中的动物切片。3、一抗浓度摸索：主要参照说明书推荐的浓度，并结合文献中对于某种组织的大概浓度范围，同时也要考虑不同公司之间同一抗体的浓度和效价的不同。从最高浓度向

1 回答709 围观

问如何避免荧光素提前衰退？

丁香实验

1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；2、选择质量好的荧光素标记的二抗：亲和力强且衰退时间延长；3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；4、拍照时尽量缩短激发光对切片的照射时间，最好在暗场环境；5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。6、荧光素标记的二抗浓缩液一定要避光保存：没加石蜡，最后-70度以下低温保存；若加了石蜡油，则-20度保存即可。

1 回答637 围观

问如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？

丁香实验

产生原因：（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分

1 回答569 围观

问组织免疫荧光染色必需用Triton吗

丁香实验

用丙酮固定细胞或是冰冻切片可以不许要破膜。丙酮本身就有改变细胞通透性和使蛋白沉淀的作用。——要看你做的蛋白存在于胞内还是胞外。胞外，一般是胞膜上的，可以不用Triton。胞内的，包括胞质内，胞核内的，那就得用了，不用的话，染到的阳性细胞只是其中的一部分。

1 回答938 围观

问花板无梯度背景高是怎么回事？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中的孔有颜色但没有梯度，背景也可能较高，。出现该现象的可能原因：底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存，实验前溶液已经变蓝。孵育温度过高或者孵育时间过长，发生了较强的非特异性吸附。没有按说明书要求洗板，特别是洗板时洗涤液的量少加了。加样时没有换枪头造成交叉污染。花板现象：低浓度或者低活性的包被抗体或者检测抗体，封闭不足导致的本底不稳定，洗板不充分，包被

1 回答329 围观

问出现白板现象是怎么回事？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中所有孔的颜色均为无色，即无信号呈现。出现该现象的可能原因：试剂已过保质期，不同批次稀释液交叉使用。错加漏加检测A，检测B或者底物溶液TMB。洗板或者加样过程中，酶标记物被污染失活，稀释液中含有酶抑制剂如叠氮呐等。配置稀释液的蒸馏水可能被污染。洗涤液是浓缩型的，没有按比例进行稀释。酶标记物的活性和效价比较低。溶液的PH值不正确，一般稀释液的PH值应

1 回答451 围观

问研究人血清中的一个蛋白，目前正在制备单抗。请问在用Elisa检测的时候用什么做标准品好？如果就用合成的重组蛋白是否合适？

丁香实验

首先回答你标准品这个，既然称之为标准品那么就可以作为标准的物质，那么就一定具有一定的溯源性。就实际情况来讲你用重组和天然的都可以，因为这两种在商品化Elisa试剂盒中都有使用。那么基于你这个问题再深入聊聊。首先我们分为两类：一是你想做个Elisa检测仅仅用于你项目或者论文的一部分；二是你是准备做商业化产品。第一种情况，你只需要大致做做，用重组就可以。不用深究；第二种情况，这种情况要求你论证更充分。

1 回答339 围观

问ELISA检测时，如何排除其他抗体干扰？

丁香实验

就问题来讲我我认为是这样的体内的Ig的不同形式其实是存在在免疫的不同时期的，或者我们理解为半衰期不同。那么最后起到作用主要还是IgA，其他的都比较少。那么你想排除干扰，这个一般是在你产品的检测系统上下功夫。比如你二抗的特异性等。纯粹去除的，并且简单可行的我没遇见过。

1 回答605 围观

问切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？

丁香实验

a.也许是抗体本身有问题，因为有很多公司的抗体质量并不好，很容易上背景，可以换一种抗体试试。b.如果经费不允许换抗体的话，你可降低抗体的浓度，并随时注意观察显色，在能看到信号的情况下尽量降低背景。c.可以换一种封闭液，不同的封闭液对某种来源的抗体来说，会有不同的封闭效果。d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所检测动物组织的正常血清，这样可以去除一部分非特异性染色。

1 回答721 围观

问免疫组化结果老是出现阴性结果？

丁香实验

免疫组化出现阴性结果有可能组织本身就没有信号，也有可能是抗体出了问题。你可以找一些阳性组织做一下，以确定是抗体的问题还是组织本身就没有所检测的抗原表达。还有，你可以提高抗体的浓度，或者试一试抗原修复等方法，也许会得到意想不到的结果。

1 回答788 围观

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