实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

问在封闭缓冲液中加入人表面活性剂，如何选择合适的去污剂？

bqejjh123

好的去污剂首先应该能够充分裂解细胞，溶解其中的蛋白，并对后续的实验研究没有影响。对于想要得到保留天然构想的还是变性的蛋白质，这才是第二考虑的问题。没有一种去污剂可以适用于所有的实验研究，即使应用于同一种实验技术，去污剂效果的好坏还取决于实验所分离的蛋白质（表格1）。因此，通过尝试和失败经验，可以帮助我们找到最合适的去污剂，此外，还可以尝试使用去污剂的混合物。需要再强调的是，配置新鲜的去污剂缓冲液也

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问如何更好的进行免疫细胞的激活和分化？

dxy_gwrp7ndq

可以利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中，以便得到激活的免疫细胞。也可以加入活化液（刺激因子）进行激活

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问为什么提取RNA的时候一定要分层？如果不用分层就能提取出RNA，这样在吸取含有RNA的水相时就不怕污染了。

whilt-shirt

提RNA过程中分层是因为加入氯仿，氯仿会从trizol中萃取RNA，在吸上层的时候可以考虑不完全吸掉。如果经费充足的话可以考虑柱法提RNA，这种方法污染小。

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问EMSA实验为什么shift有两条带

whilt-shirt

1）曝光或者成像时间过长。2）封闭时间不足或者效率不高。3）洗涤效果不佳。4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。

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问为什么转膜之后用TBST越洗越淡？

桐轩456

我觉得你如果用TBST洗5miundefined3次，封闭敷抗体，密闭室温改为2小时去试试。

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问如何高效的向原代细胞转染SiRNA？转染试剂？转染时间？

bqejjh123

　选择合适的siRNA转染试剂是的RNAi实验成功另一个关键。由于细胞毒性对siRNA实验有很大影响，它直接影响实验的结论和结果，因此必须选择低毒性转染试剂，以观察转染试剂的毒性是否较低。有一个简单的方法，看转染的过程和要求，比如要求的细胞密度越大，说明毒性越大，

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问请问大家都是怎么做小分子抑制剂找通路或者靶点的？最佳使用浓度怎么确定？

bamboopiggy

现在可以通过买一些公司的药物库，直接高通量筛选，有用的小分子药物。一般是高通量10um的药物浓度，筛出有用的小分子化合物以后。再扩大浓度梯度，找到合适的浓度，至于小分子药对应的靶点，一般文献里，或公司给的说明书里会有，selleck应该就有这样的药物库

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问如何提高纯度，试剂盒过柱提取结果不太理想

whilt-shirt

加洗涤液多洗几遍，多过几次柱子试试。

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问Qupath软件的使用方法？

bamboopiggy

我没有用过这个软件，但是看你提了，我好奇是个什么软件，原始链接在这里，你可以直接点链接去看看：https://blog.csdn.net/qq_40662074/article/details/104968297这个帖子包含了以下内容：软件安装软件下载软件安装【windows版】简单使用文件打开人工标注标注导出和导入几个重要的官方说明书

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问做WB提取膜蛋白时有什么注意事项？

dxy_gwrp7ndq

电转印膜的选择：有NC膜、重氮化膜和阳离子尼龙膜，PVDF膜。其中NC膜使用的最为普遍，它的蛋白质容量大，可用各种染色方法进行检测，但是它与蛋白质的结合是非价性的，膜干燥后很脆。此外膜的孔径大小也是考虑的重要因素，目的蛋白30KD以下用0.22 um孔径的NC膜，30KD以上用0.45 um孔径的NC膜；转印选择恒流，每个转印槽150 mA，10KD以下转印40min，10-30KD转印50min

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问请教各位大神，WB条带过浅有什么补救的办法吗，后期可以调得清楚些吗😭😭

府宅

1：你的蛋白的量的多少，要保证一定的蛋白总量2：转膜的参数设置：100mA,4小时，冰浴3：背景太深，是不是你的二抗浓度太高以及洗膜的时间不够，15分钟/次，共1小时

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问跑WB被上样的针尖戳了，其上的肿瘤蛋白会对人造成危险吗

bqejjh123

一年前的时候跟同学做他的小鼠荷瘤实验，操作中老鼠没拿稳同学慌了自己扎了一下左手鱼际，就是用注射腹水瘤的针头，当时大家都很紧张，讨论这个问题会不会把肿瘤移植的自己身上来。肿瘤移植我做过不少，昆明小鼠和裸鼠都接种过，一般来说成瘤率100%，个别没有成瘤的怀疑是操作有误。但从来没有人在自己身上做这个实验，也没试过是否那样的针头（注射过或者抽吸有细胞悬液的针头）扎一下自己后果怎样。从理论上来讲（肿瘤的血道

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问为什么Wb 转膜会出现白板？

府宅

排除蛋白问题，抗体问题，再出现大白板很有可能就是转膜的问题了，试试改变一下转膜条件，转膜完成以后用丽春红染个膜大概看看转膜效果

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问免疫介导的需求量到底有多少？

dxywode

疫情推动下免疫球蛋白市场需求量攀升。16年，静丙批签发维持较高增速，分别达到19.8%、32.7%和25.2%，2017年和2018年批签量分别下滑0.3%和3.5%，2019年静丙签发量增速达9.2%。

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问细胞膜的两种提取方法？

bamboopiggy

1.对于水溶性的细胞膜蛋白，可以采用反复冻融的方法，但是对于疏水蛋白就需要用到去垢剂，所以如果方便最好还是用低渗的方法提取，因为里面直接加了去垢剂。2.细胞破碎仪是会产热，但是你可以将你样本管放在冰水浴中，然后再用破碎仪震破细胞，这样基本不会影响蛋白。以上两种意见如果不放心，最好先做一个预实验，试一下，那种方式对你来说合适。

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问怎样提高免疫发光实验的效率？

wuli猫宁

一、细胞密度1、保证玻片上的细胞以单层细胞生长2、细胞生长速度3、保证爬片是无菌的二、孵育抗体1、一抗浓度过高；2、一抗孵育之后洗涤不充分；3、一抗特异性不高，这时候你要考虑这个蛋白是细胞本身就表达的还是转入的质粒表达的； 4、可以查一下抗体识别序列，看看是否有同源性的蛋白。三、DAPI复染细胞核四、封片

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问以EDC和NHS做催化剂，TPGS-COOH和4-NH2－Tempo为原料，二者发生酰胺反应。

丁香粉猪猪

ph值4缓冲液体中，反应48小时室温

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问E.coli表达His-tag蛋白有哪些操作注意事项？

岳努力岳幸运

1.蛋白纯化的条件：首先，看一看这个蛋白在文献中有没有纯化过，可以参考。如果从来没有人纯化过，除了提到的诱导剂浓度，温度和时间，其实裂解蛋白的buffer更重要一些，根据蛋白的等电点看一看酸碱，根据蛋白是否容易沉淀看盐浓度，根据蛋白是否稳定看蛋白酶抑制剂和还原剂…除了buffer还有wash buffer和elute buffer中咪唑浓度也挺重要的。2.如何看蛋白分子量：把测序结果从起始到终止的

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问蛋白质定量实验原理？

君君子丶

BCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓度定量试剂盒是在丐界上常用的蛋白浓度检测方法之一BCA法基础上改迚而成。二价铜离子在碱性的条件下、可以被蛋白质还原成一价铜离子。biuret reaction。、一价铜离子和独特的BCA Solution A、含有BCA，相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子。形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸

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问玻片制备如何提高准确率

bqejjh123

注意仪器校正，具有准确体积的和质量的仪器，如滴定管、移液管、容量瓶和分析天平砝码，都应进行校正，以消除仪器不准所引起的系统误差。

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