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实验问答

28,291,411 科研人在看

问同一个蛋白（带his-tag），分别用his和其特异性抗体去免疫，WB结果，his的正常，另外一个什么也没有（同一个人同时进行）

dxywode

WB或者anti-his的抗体检查His是否表达；从上游构建入手，改变His-tag的位置（C-terminal or N-terminal），必要时增加His个数（常用6-10个）

3 回答434 围观

问western提取出来的蛋白质保存方法？

府宅

蛋白样品放到-80℃也并不完全保险，虽然能存放久一些，但是最好不要冻融超过两次。蛋白浓度测定后，可以加入loading buffer 煮样，煮后可根据实验需要分装成小管，下次实验前拿出小管再次煮样即可。

6 回答3653 围观

问提高电泳分辨率的途径有哪些？

bqejjh123

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高电泳的分辨率。

4 回答1196 围观

问westernblot加样的顺序是什么？

dxy_gwrp7ndq

上样顺序一般是让与抗体有反应的样品和没有反应的样品间隔开，这样条带之间反差比较明显。

4 回答2591 围观

问WB中内参的意义是什么？

dxy_gwrp7ndq

1. 是看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候，内参照蛋白有条带，而目的蛋白没有，说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题，是目的蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。2. 是比较客观的说明目的蛋白的表达情况，消除上样量等的误差。不同的标本之间由于蛋白提取的量有差别，可能强阳性的表达跑出来的带很弱。因此设立内参照，比较不同标本之间的表达情况。

3 回答11499 围观

问引物设计特异性好，但跑胶有隐约杂带是为什么呢

府宅

1.外源DNA污染，确保操作的洁净；2.Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度；3.若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

4 回答921 围观

问免疫组化时染色比较弱拍图不好看怎么调整？

dxywode

小心处理组织样本，尽量保持组织细胞结构的完整性。如果组织的穿透力差，则要制备较薄的切片。调整好固定液的理想pH、固定时间和温度。可考虑用单抗（不是多抗），避免交叉反应。如果非特异性结合太强，则适当减少抗体的孵育时间。

3 回答1316 围观

问做WB曝光后目的蛋白位置出现2个相邻条带，但是抗体说明书上没有提过会有2条带情况，原因可能是什么呢？

邓豆豆逗

可以先看一下抗体官网的一些效果图，是否做出来有两条带的现象，其次查一下相关文献，看这个蛋白是否有剪切体或一些修饰之类的，还有可能是蛋白降解了，这时候可以找一个阳性对照一起做，如果阳性对照是单条带，就考虑是样本的原因了

6 回答4518 围观

问怎样提高WB实验蛋白定量与上样量的效率及准确性？

bamboopiggy

这个，只能说勤能补拙，多做，经验丰富了就好了。一般情况下，在做标曲的时候，加样要准确，标曲出来的R^2值，接近0.99最好。样品稀释时，枪尖要和枪match，吸液时，枪尖别下的太深。上样时，同样注意枪尖和枪的match程度，以及枪的准确性。

4 回答918 围观

问蛋白质的等电点是否与蛋白质的质量有关？

天一湖医者

蛋白质是两性电解质，其等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关。各种蛋白质因氨基酸残基组成不同，等电点也不一样。

5 回答1260 围观

问内参蛋白有什么区别，如何选择合适的

府宅

1. 胞浆蛋白的内参与胞核蛋白的内参是不一样的；2. 在一定的实验条件下，内参蛋白的表达发生明显的变化时需要选择其他表达不变或者变化很小的蛋白；3. 当研究的蛋白的分子量与内参接近时，需要选择分子量与目的蛋白的分子量差距比较大的蛋白。

4 回答2825 围观

问请问梯度胶好用吗？可以同时收集到20kDa和150kDa分子量的蛋白吗？

dxy_gwrp7ndq

使用梯度胶，小分子量蛋白运动至在胶浓度更高的底部（正极），同时大分子量蛋白在顶部有更好的分离。如下图：选择最佳的丙烯酰胺凝胶浓度达到高效的蛋白分离

4 回答672 围观

问蛋白印迹实验和流式细胞术都是使用抗体来检测细胞内靶标物质，两者如何选择

whilt-shirt

根据需要吧，但是最好两者都做，这样结果更可靠

3 回答536 围观

问纯化后的蛋白质怎样保存？

dxy_gwrp7ndq

1. 低温低温下保存蛋白质是极其必要的。低温意味着更低的能量，低温下蛋白质分子热运动较低，其内部的成键不容易断裂。另外，在低温下，微生物不容易生长，可能存在的蛋白酶的活性也会很低，这些更容易保证蛋白质的活性。2. 分装蛋白质有时候是需要冷冻保存的，但我们使用蛋白质时却是在室温或者更高的温度。冻融这一过程会对蛋白质造成不可逆的损伤。因此我们需要尽量减少冻融的次数。纯化后的蛋白质，进行分装保存，每次需

4 回答4601 围观

问如何避免蛋白质谱实验中的二次污染问题

府宅

在质谱分析中，最常见的蛋白质污染物包括角蛋白和血清白蛋白。其他质谱（MS）蛋白污染物还包括酪蛋白和大肠杆菌蛋白质。在实验中，可以通过以下方法避免将上述蛋白质污染物引入样品：1. 保持实验室清洁、减少灰尘和空气流动；2. 使用一次性过滤吸头；3. 定期清洗电泳、染色、微量离心机等设备，避免通过接触或气溶胶引入污染物颗粒；4. 穿戴洁净的实验服和手套。

4 回答1705 围观

问MTT实验时怎样避免血清干扰的问题？

bamboopiggy

血清不会影响mtt的结果啊，因为你加完mtt以后，要吸出，然后加dmso溶解甲臢，不存在血清影响的问题。如果你用cck8也没事，会对cck8造成影响的是氧化剂，不是血清。

5 回答1119 围观

问怎样有效减少His标签蛋白纯化效果不理想的问题？

迟C迟

1、His标签在中性或碱性条件（pH7~8）下，与Ni2+有更强的结合力，与Tris-HCl缓冲液相比，在磷酸缓冲液中His标签表现出与Ni2+更强的结合力。2、HisTrap HP和HisTrap FF的蛋白结合载量都是至少40mg (His) 6重组蛋白。大家可以根据填料的结合载量选择预装柱和填料的规格。3、如果目标蛋白中的咪唑需要去除，可以根据样品体积选择适合的上机脱盐柱（HiTrap De

5 回答1542 围观

问凝胶过滤层析过程中发现分辨率不高的常见原因有哪些？

府宅

1.加样要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25

4 回答2094 围观

问使用随机引物是否对样品质量要求更高？在提的时候有没有需要特别注意的？

dxywode

使用随机引物，即使使用的质粒DNA模板微量也能够进行反应，其在反应时对模板没有较为严格的要求。注意事项1.模板DNA应当为线性的。2.需要认真调整引物与模板的比例，如果引物比模板高，那么会得到较短片段的探针，然而累积较多的产物；相反，则反应产物比较长。

3 回答436 围观

问miRNA相关试验如何开展呢？

dxywode

3 回答611 围观

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