实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问WB的泛抗体实验中，为什么总是出现只有一条带的情况？

bamboopiggy

你说是泛素化抗体么？如果是的话，可能因为你那个泛素化的蛋白，在出条带的大小表达的最多，所以曝光浅的时候,能看到一条带,而不是多条带

4 回答1173 围观

问如何避免荧光定量pcr检测技术的实验误差?

迟C迟

可以从以下几个方面考虑：1、样品的处理及选取处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。选取实验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织，样品选好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。2、核酸提取加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核酸质量，RNA OD260/280=2.0左右，DNA OD260/280=1.8左右，最好再做电泳检测

3 回答609 围观

问同样的抗体同样的稀释比例，前一次可以敷出正常的条带，但是用于不同批次的相同处理的样品时敷出了反白的条带，是什么原因？如何解决？

bamboopiggy

反白条带出现，大概率是你蛋白浓度太高，出现了烧心现象，还来不及拍照,大量的辣根过氧化物酶就反应了,把发光试剂消耗掉了，从而没有光了。

3 回答237 围观

问跑出来的胶，杂带太多，怎么回事儿？目的条带都看不清，被杂带覆盖了。

whilt-shirt

可能是抗体浓度过高导致的，建议稀释抗体试试

4 回答463 围观

问请问外泌体的生物标志物如何选择，如何鉴定啊？

vae1476

正好最近在做，外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63、CD81和CD9)）、热休克蛋白家族（(HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)以及一些细胞特异性的蛋白包括A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-II(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。其中CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70、ALIX等，是最常

3 回答1073 围观

问蛋白质样品可以反复冻融吗？

迟C迟

蛋白样品不建议久存，也不要反复冻融。下游做WB实验，建议蛋白浓度测定后，加入loading buffer煮样，煮后根据实验需要分装成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮样即可。

6 回答3952 围观

问请问有做磷酸化的蛋白，造模时间不同，做出来结果完全相反的吗？

whilt-shirt

首先得确定造模是成功的，建议重复试试

4 回答210 围观

问如何确定WB结果中目的蛋白位置高于预测位置的原因

whilt-shirt

可以通过更换不同的marker来确定

5 回答900 围观

问银染和WB哪个灵敏度更高？

迟C迟

银染的灵敏度高，但是有时候操作不好胶就变成大花脸了。

3 回答1412 围观

问WB条带周围总是黑黑的一团，不知道怎么回事

未来9

可能的原因①膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液。②一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度。③ 一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。④选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点。⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。⑥检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。

3 回答6285 围观

问为什么WB条带一个位置总是有两条，只敷了一种蛋白？

whilt-shirt

可能是抗体的特异性不好，也有可能是抗体浓度过高

5 回答1097 围观

问跑出来的带总是弯弯曲曲的怎么处理？

bamboopiggy

灌胶匀一些，或者低电压跑慢点，或者用软件拉直。

4 回答355 围观

问跑出来的带总是很弯曲是哪里出了问题？

whilt-shirt

配胶没混匀，或者电泳液有问题。

4 回答249 围观

问请问大分子目的蛋白，本底表达低，每次跑出来都只能看见maker，目的条带都很若，有什么解决的办法嘛？

迟C迟

6 回答445 围观

问WB条带白色背景黑色是什么原因？

dxy_yjs8h877

很多时候是因为封闭的不好，或者洗膜洗的不干净的原因导致的。

7 回答8701 围观

问跑蛋白胶的maker用多少合适呢？

dxy_yjs8h877

一般为了节省都用5ul左右就够了，怕不好点样的话可以适当稀释一下然后加大用量也可以。

6 回答2319 围观

问两块胶一起转膜，为什么一个成功一个失败？

天一湖医者

考虑到会不会是封闭时间不足或者膜有没有出现干了的现象。

4 回答713 围观

问做WB的时候用商品化封闭液封闭结束是否需要用TBST洗脱后再加一抗孵育？用脱脂奶粉的时候是洗脱的，不知道这种成品是否仍需要？

vae1476

每个商品化封闭液都有自己的Protocol，所以要按照说明书来做，其优点是封闭时间很快。

3 回答661 围观

问求解：WB提取蛋白时，什么情况要加DTT？作用是什么？比例多少？

未来9

如果是本来就有正确结构的蛋白是不需要加DTT的，如果是变性的蛋白，并且其一级结构中含半胱氨酸，那么缓冲液中加DTT，并且逐渐减少DTT浓度。DTT是防止错误的二硫桥形成的，蛋白会先向正确结构形成二硫键，但是这个过程较为缓慢，如果直接不加还原剂，那么正确的和错误的二硫键都会形成。所以慢慢的降低DTT，使蛋白形成正确的结构而不至于形成错误的二硫键。如果4xloading buffer中不含有DTT就按

6 回答19415 围观

问WB实验做完了，所有条带颜色都很浅怎么回事呀？

fenfen1110

还有一种可能：是不夹板夹的不够严实，导致转膜不完整

8 回答1924 围观

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