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问
WB时为什么跑出来的条带总是斜的
迟C迟
主要可能是电泳凝胶配制时未搅拌均匀,造成条带未能直线跑完,电泳凝胶中混入气泡,造成条带被挤压倾斜,也可能是样品和缓冲液有干扰,造成条带迁移率不统一,另外上样量过大,被其他泳道挤压也有可能。
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问
蛋白裂解到底多长时间就可以呢?
迟C迟
加RIPA裂解液,4℃摇床上裂解26h和14h即可。
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问
敷内参tubulin出现70kd左右的条带是为什么?
dxy_gwrp7ndq
可以用已报道的该蛋白有表达的细胞系做一个对照,最好是抗体说明书上用到的细胞系,这样就可以看看到底是你样品的问题,还是WB体系的问题。
6 回答
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问
我在跑蛋白的时候,经常遇到泳道一个隔一个有印记,中间的泳道空空如也的情况,检查了转膜液 电泳液 都没有问题,是怎么回事?
bamboopiggy
主要有泳道的影,就不是液体的问题,大概率是你的蛋白坏掉了,建议用新鲜样品。
4 回答
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问
使用快速封闭的试剂,封闭时间过长会导致一抗孵不上去吗?
bamboopiggy
不会减少封闭时间,只是为了缩短你最实验的时间,封闭时间长了没问题。
7 回答
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问
制胶的时候上层浓缩胶制少了,下层多了,但是梳子插得进去,在跑的时候怎么设置参数?
bamboopiggy
可以适当降低电压,由原来的80吧,改为40-60v,跑的慢一些。让蛋白在浓缩胶和分离胶之间能压成一条线就可以。
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问
保存的蛋白质复性,一般使用多少度水浴?到什么程度是复性成功呢?
未来9
样品放入零下20度冰箱中储存,需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样,以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
3 回答
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问
同样一起跑的条带两边跑的速度不一样是因为什么?
bamboopiggy
大概率是你胶灌的不匀,但是也可能是跑胶槽子里的金属丝坏了,导致电流不匀。
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问
染色的标本的核周围有杂质?是什么地方有问题?
bamboopiggy
大概率是你的抗体坏了,看看需不需要重新配抗体,或者洗片子的时候,多洗一次。
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问
封片的时候建议用甘油-明胶还是树胶?或者树脂?
bamboopiggy
都可以,现在有那种固体封片剂,更好用,不会污染机器。
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问
最终染色不均匀是孵育温度有变化吗?还是别的问题?
bamboopiggy
是你抗体加的不均匀,温度也会有影响,但是抗体的原因比较大。
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问
0.3%H2O2-80%甲醇室温孵育这一步,是将两个试剂混合加入后孵育吗?
bamboopiggy
是,用甲醇配置H2O2,到0.3%,加入孵育。
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问
分光光度测定抗体所使用的抗体的稀释倍数是多少?需要根据补体类型进行调整吗?
bamboopiggy
你用分光光度计测,相当于测蛋白浓度,这个就取决于你测的时候,抗体的浓度和你分光光度计的范围,把抗体稀释到你机器能读的范围内就可以。
2 回答
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问
在肉眼或者镜下观察空斑的时候,还是只计数两条边的吗?还是全部都要计数?
bamboopiggy
方框,按照规律,只记数其中相邻的两条边。
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问
从胚胎中提取RNA时,应注意哪些原则?
迟C迟
1. Trizol试剂含有苯酚,具有毒性和刺激性,注重操作。2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉,注重配带手套,样品尽可能盖严。3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率,因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质(结缔组织和骨除外)。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作,防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。
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问
荧光素酶互补实验验证蛋白互作的载体图谱以及酶切位点
bamboopiggy
仅供参考,不知道你手里质粒的名称,只能猜测是这个俩个吧
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问
SDS凝胶电泳的上样量大家一般用的多少啊?
未来9
一般上样体积为10-15μL(即2-10μg蛋白质)
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问
WB实验中条带没有间隔的原因?
bamboopiggy
感觉是你上样浓度太大了,试试降低浓度。还可以降低抗体的浓度。没有间隔。主要是因为发光太强了。
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问
怎么通过氨基酸序列推测它在折叠后的空间结构域
bamboopiggy
网上有好多预测工具,你可以试试,尤其最近AI出现,更方便了。如alphafold2
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问
细胞生物标记物检测的方法:WB法和流式细胞仪,单用一个就行?还是必须联合使用
listener0014
另外一个也看经费是否充足,如果不差钱,肯定是越全越好
4 回答
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