实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问两个一抗宿主都是rabbit，有没有办法共染，一个表达在核，一个在胞质，拍共聚焦

bamboopiggy

我在武汉塞维尔做过，同是rabbit，三染的，他们说可以洗掉再染。染的还不错。我估计就是加一个一抗，加一个二抗。再加一抗，再加不同色的二抗，这么做的，可能对片子制作的要求比较高。

2 回答507 围观

问一抗没有明确标明可以做IF，但是可以做IHC，可以用来做IF吗？

未来9

没写或者说没做过IF相关实验的，应该问题不大

3 回答1302 围观

问大概多久测一次过氧化氢酶活性

未来9

测定方法中说是一分钟测一次,共测4次

4 回答576 围观

问从左到右依次为input IgG IP组，这是不是没洗干净啊？我用PBS在垂直旋转仪上高速洗3遍每次10分钟。请问怎么解决？

bamboopiggy

是没洗干净，应该用你收细胞的的lysis洗，不是pbs洗。

1 回答412 围观

问没有目的条带，背景很干净是为啥？

JCorona

你是做WB吗？如果是的话，那么有可能：1.抗体失效或者特异度不够，导致无法与目的蛋白结合而催化发光；2.蛋白降解（可能是自然降解也可能是酶解），小肽段一来可能失去抗原表位，二来可能电泳时跑到胶外

11 回答371 围观

问WB有杂条带是是怎么回事？

JCorona

可能的原因：1.样品本身纯度不够；2.所用的溶剂（例如loading buffer）含有蛋白质污染；3.目的蛋白发生降解，杂带实际是目的蛋白的分解肽段

10 回答8727 围观

问做southern blot 时，在进行紫外交联仪固定时，参数应该调到多少J呢

天一湖医者

120000microjoules/cm2

4 回答381 围观

问怎样提高Western Blot 的转膜效率？

辛勤劳动创造财富

浸泡PVDF膜5-10分钟，或者增加转膜时间，一定要注意散热，这很关键，冰融化了要及时更换。

6 回答4174 围观

问WB杂带多怎么回事，做了好多次都是

迟C迟

.1.原因：细胞系传代次数过多，蛋白表达谱发生变化。建议：使用未传代或传代次数较少的细胞系（不超过15代）进行样品制备。 . 2 .原因：与细胞系裂解物相比，原代细胞或组织提取物会倾向于有较高的背景和降解条带。建议：1. 用新鲜提取的，经过超声处理的澄清的组织提取物能降低背景。2. 同时，用去垢剂含量较高的RIPA buffer裂解组织，可得到裂解更彻底、一致性更高的裂解物。 . 3 .原因：蛋白

6 回答5724 围观

问找不到蛋白抗体，可以用其他物种的同蛋白的多抗么？有没有什么办法可以检测出暂时没有抗体的特定物种蛋白的表达情况？

bamboopiggy

看你蛋白的保守性如何，如果保守性好，可以试试别的物种的抗体。对于没有特定抗体的蛋白，可以试试从rna水平先检测一下表达，跑个realtime pcr

2 回答275 围观

问如何去除RNA提取过程中的蛋白质污染

dxy_gwrp7ndq

提组织的RNA有的时候蛋白的含量会很多，可以在加TRizol和氯仿抽提完第一次以后不加异丙醇，而直接加入TRizol氯仿再抽提一次，第二次抽提后会发现中间的蛋白明显减少的，如果感觉蛋白还是很多的话，再抽提一次也是可以的。

6 回答7367 围观

问【求助】提组织RNA时，为何OD值总是小于1.8

迟C迟

RNA 260/280<1.8说明有蛋白质、酚的污染。

6 回答3853 围观

问WB内参总是不齐怎么办？

Lv花开花落

1.定量是否准。不知道题主实验室是用什么方法来进行蛋白定量。我们组是用蛋白标准品和标准曲线的方法进行定量。这种定量的方法要注意用的移液枪准不准（一个量程的话，每次加的都不准的现象要避免）；样品的浓度要在标准品画成的标准曲线中部；标准曲线的R方要大于0.99；枪头插紧，避免有气泡。配样品时要注意弹匀每个组分。2.跑胶过程中，如果移液器无法锁定量程的话，要看一下每一枪加的是否一样。3.选择一个适合自己

4 回答3980 围观

问转膜的时候怎么判断有没有把目的蛋白转移到膜上？

未来9

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

5 回答625 围观

问在样本制备和加样的过程中，所有会影响蛋白上样量的可能因素有哪些？如何提高蛋白上样量？

未来9

1、影响因素：样品浓度，蛋白裂解是否完全2、可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的，建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，以增大上样孔体积，可以试1.5mm厚的胶。

3 回答368 围观

问为啥我跑的BCL-2 ，缺复氧组比对照组还多

A9032

建议重复实验，同时关注BAX，以及BCL2/BAX比值，BCL2的磷酸化水平的改变。

3 回答377 围观

问BCA测蛋白浓度，溶液变蓝色是为啥呀，我看标准品都没有蓝色

JCorona

你想说的应该是标准品变成紫色，而样品变成蓝色对吗？我也遇到过这种情况，我推测是显色反应受到目的蛋白氨基酸序列中四个氨基酸残基（半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）的影响。其实也不用太纠结这个，检测波长别弄错，标曲没问题就行了，这个本来就是测个大概，精确度没那么高的

3 回答2111 围观

问用慢病毒包装的方式做基因敲降，病毒滴度低，感染THP-1细胞，用puro筛选后，大部分细胞死掉了，怎么样提高病毒滴度？

喵喵喵柏

Thp-1不好转染，亲测原代细胞好转。建议重新摸puro的浓度，可能是浓度的问题，设置浓度梯度，看细胞死亡的数量。病毒滴度是包装病毒的厂家设计的，有不同种的浓度，这个应该和厂家沟通，或者提高加入病毒的量，并调整转染病毒的试剂的含量，及时换液

3 回答1094 围观

问如何从一段DNA序列得到翻译的蛋白质,并与已知DNA序列进行比对?

cxsm

你这个应该是想比对测序数据吧，个人认为没有必要换成蛋白序列再去比对。这个可以按照如下流程:1.打开NCBI的网站，一直拉到页面的最下端，在popular纵列里点击blast，2.进去页面点击核酸的blast，3.align two or moresequence勾选上，再将目标序列和模板序列复制进去，点击blast，网页就能显示比对的结果了。

2 回答810 围观

问如何确定尾静脉注射时针头已经进静脉？

羞菲cherry

推进时无阻力是判断尾静脉注射成功与否的标准，打得很费劲和鼓包都是没有进入尾静脉的

1 回答2728 围观

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