实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问如何选择合适的elispot试剂盒，要做疫苗抗体效价检测

天一湖医者

1、查找待测样本的蛋白浓度　可以通过NCBI的文献，给出的蛋白表达量参考值来比较elisa试剂盒给出的样本值与报道值是否一致。2、试剂盒的应用种属、检测样本的种类　　除试剂盒特别说明外，一般不同种属不能通用。常见待测样本种类有：血清和血浆（不同抗凝剂），细胞上清，和细胞裂解液，试剂盒中不同样本的稀释液不混用。3、•.检测范围： •建立线性范围：需测定9-11个浓度水平，每个浓度水平重复测定3-4

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问培养瓶是用密封盖好，还是用透气盖好？

Eason老歌迷

各有好处，其实都差不多。密封盖是一次成形不带内垫,常用于密闭培养,可保证其密闭性。透气盖的话，瓶盖带有0.2μm疏水滤膜,提供无菌气体交换,减少污染的风险.常用于开放培养,推荐用于CO2培养箱培养,尤其适用于需要长期培养的实验。

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问细胞培养过程中出现碎片如何处理？

Eason老歌迷

我比较常用的几种方法一个是稀释法。细胞稀释后还能增殖，会越来越多，而细胞碎片相应地会越来越少。还有就是自然沉降法。将细胞悬液移到离心管中，等细胞大部分下沉时，可将上液吸弃，再加入培养液悬浮细胞，此方法可反复使用，同时每次可显微镜下观察是否符合你的要求。

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问复苏后应不应该立马去除掉DMSO?

Eason老歌迷

肯定的啊。细胞复苏后是需要立即离心去DMSO，这样可减少DMSO对细胞的损害，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大。

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问为什么将质粒转化到感受态细胞中，培养基培养后再提取质粒?

balalaLy

质粒转导进感受态后可以随着感受态细胞的增殖质粒得到复制扩增

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问蛋白质SDS-PAGE实验的问题？

Eason老歌迷

目的蛋白条带太弱，有几个原因。可能是你的蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不多。可能是你转膜没转好，没转完全，用丽春红染一下看看。可能是你的抗体稀释浓度太低了，或者是孵育时间太短。也可能是你的显影问题，增加一下显影时间。

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问Qpcr扩增内参和指标的CT值相差太多怎么办？内参Ct是13，指标Ct是30

Eason老歌迷

相差太大的话，你重新p一次吧，Ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。

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问扩增曲线平台期不平，循环增加荧光值下降是什么原因？

Eason老歌迷

有可能是你的仪器不稳定导致的扩增曲线异常。或者是可能是卤素灯老化所致发射光源不稳。或者是考虑仪器或者孔位问题，还要考虑反应体系是否存有气泡。

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问重组质粒不表达，什么原因？

Eason老歌迷

菌落PCR的假阳性非常高，应该挑取多个阳性菌株，加入抗生素小摇之后将菌液送去测序，然后再选取正确的菌株进行重组表达，因为，还有可能存在载体上根本没有目的基因的情况，当然就不表达了

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问敲除基因后的基因组与野生型基因组如何比对序列？

Eason老歌迷

可以通过pcr鉴定的方式来确定。也可以用dna序列软件，进行测序结果与野生型序列进行比对，如果发生非3倍数的indel，则说明该细胞系在基因组水平上已经实现了敲除。

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问请问同源重组引物设计怎么考虑移码呢？

Eason老歌迷

如果你的目的是让目的基因不表达,抗性基因自带启动子不需要考虑移码突变。你的抗性基因表达是从启动子开始的,与之前乱七八糟的无关。

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问求助|TLR抑制剂（TAK-242）和激动剂（CRX-527）的用法

天一湖医者

TLR抑制剂（TAK-242）常用剂量为0.5mg/kg。激动剂（CRX-527）常用剂量为5-10ug/kg

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问求助：皮质酮损伤细胞造抑郁症模型，皮质酮应该怎么溶啊？

秋秋欣欣

先用促溶剂后，再加定溶剂：因为我们的实验中用到了DMSO（二甲基亚砜），它是一种促溶剂，所以我们在溶解皮质酮时，先用少量的DMSO（也就几滴）使皮质酮微溶，再加其他试剂（比如d-Hanks、生理盐水、无水乙醇（可能有影响）等）定容配制皮质酮溶液。

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问小鼠肺洗液怎么做Elisa，稀释方法和血清一样么

bamboopiggy

稀释方法是一样的，但是要做个预实验看看需不需要稀释

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问RNA的提取用什么方法最好，检测结果如何最准确？

天一湖医者

常见的RNA提取方法i沉淀法Trizol裂解液是总RNA提取的常用试剂, 内含苯酚、异硫酸胍等物质，能迅速破碎细胞，释放核酸，并抑制细胞释放的核酸酶。1）组织中提取RNA: 第一步需要液氮研磨，将组织块放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织块变软，再次加入液氮研磨，反复三至四次后加入50-100mg/ml的Trizol，转入离心管中，室温放置10min，使其充分裂解。12000rpm，离心5

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问在做流式时，如何解决非特异性染色的问题？

秋秋欣欣

降低抗体浓度可以减少非特异性染色

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问PCR是在体外提供模板，高温变性，低温退火，室温延伸后才开始进行DNA片段的扩增的嘛

秋秋欣欣

PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

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问DNA纯化

秋秋欣欣

A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min,丢去上清夜，收集菌体。B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积

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问求助。mc3t3细胞系，血清选伊克赛还是BI

balalaLy

我以前养细胞也是用澳洲的，6300一瓶，因为大家都觉得我们这个细胞比较娇妻，后来澳洲断货，换了BI的养着也挺好

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问水化上样缓冲液II 和III在哪里用

天一湖医者

一般用于二维电泳和双向电泳实验。

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