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问
曝光总是条带附近背景很高是怎么回事?
天一湖医者
抗体浓度过高。如果使用过高浓度的抗体,它们可能与印迹膜发生非特异性结合。 这将导致整个印迹的均匀高背景。
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问
蛋白大小为40k左右,应该选择什么标签
天一湖医者
蛋白纯化首选His-Tag,Western blot首选Flag-Tag,免疫共沉淀可选择Flag-Tag或其他常用标签如HA、cMyc,活细胞成像则应该选择荧光蛋白等。
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问
在薄层分析等电聚焦的方法中,有哪些方法可以进行pH 梯度测定?
天一湖医者
等点聚焦电泳的测定pH梯度的方法有四种:1. 将胶条切成小块,用水浸泡后,用精密pH试纸或进口的细长pH复合电极测定pH值,然后作图。2. 用表面pH微电极直接测定胶条各部分的pH值,然后作图。3. 用一套已知不同的pI值的蛋白质作为标准,测定pH梯度的标准曲线。4. 将胶条于-70℃冰冻后切成1mm的薄片,加入0.5ml 0.01M KCl,用微电极测其pH。
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问
免疫组化和WB操作可以用同一种抗体吗
天一湖医者
如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。
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问
PCR实验结果发现目的蛋白无CT值是什么原因
天一湖医者
原因:反应循环数不够 一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45循环), 但高于45个循环会增加过多的背景信号检测荧光信号的步骤有误 一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号引物或探针降解 可通过PAGE电泳检测其完整性模板量不足 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的zui高浓度做起模板降解 避免样品制备中杂质的
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问
在体和离体记录信号的frequency和amplitude分别代表什么意义?
天一湖医者
频率(Frequency),振幅(Amplitude),
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问
WB样本扩散了,怎么办
Eason老歌迷
是不是你的上样时间太长了啊,上样一定要迅速。。你同时跑几块胶呢?既然已经扩散了,那么就赶紧调高电压,跑完看看吧,不行就在跑一次吧
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问
免疫组化和WB可以用同一种抗体吗?
天一湖医者
可以,如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。
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问
上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果?
天一湖医者
无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。
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问
我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB?
天一湖医者
1)可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜,转膜时间缩短,另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系; 2)也可以选择PSQ 膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。其他按步骤即可。
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问
提取蛋白后浓度显示基本正常,但是转膜后丽春红染色看不到蛋白的位置,有marker,这是怎么回事呢?
天一湖医者
可能是转膜没转过去,或者转过了。你电转缓冲体系有问题,可以试着加点SDS,会好一点。
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问
在封闭之前膜需要漂洗吗?是用什么漂洗呀?
天一湖医者
不用洗的,封闭前后都不要洗,封闭后的更没有必要洗,因为我们的抗体就是用封闭液来配的。效果都很好!
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问
吉林中医药杂志投稿
天一湖医者
没有退稿,现在投稿审核都比较慢,慢慢等吧,
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问
求教:lnc RNA干预载体的构建?
天一湖医者
1. 选择合适的载体,依据实验室现有的条件进行选择:plvx-puro,Amp,puro,其他慢病毒载体的原理相似,例如pLenti-puro等 2. 找到基因的CDS区,复制;对于LncRNA,则直接选择全部序列即可 3. 用primer5找到目的基因上没有and载体有的酶切位点 4. 确定酶切效率,在酶边是否需要加保护碱基以提高效率 5. Kozak序列(针对表达蛋白的载体,而对于L过表达载
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问
MCAO模型为什么总是进不到满意的深度
天一湖医者
插线栓主要还是要有耐心,插颈外的时候要牵扯颈外。不过只要你从颈外进到颈总,然后把牵扯颈外的线换个方向,线栓就会进到颈内了。
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问
Western blot实验时背景高且不均匀怎么办?
天一湖医者
封闭物用量不足,提高封闭浓度,使用适当体积保证孵育时完全覆盖。转印膜封闭物使用不当,检测生物素标记的蛋白时,不可用脱脂奶封闭。封闭的时间不够,延长封闭时间,抗体非特异性结合减少,抗体的浓度和孵育时间抗体浓度过高或洗涤不彻底,降低抗体浓度,增加洗涤时间和次数化学显色底物过多减少显色底物用量
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问
在表面活性剂裂解及酶解法进行生物样品预处理实验中,为避免细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中降解生物大分子,需要注意什么?
天一湖医者
为避免细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中降解生物大分子,可以加入蛋白水解酶抑制剂。
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问
WB实验跑出来的目标条带信号很弱是怎么回事
青柠清心
提取蛋白质过程中,应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶转移不完全或过转移,可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流抑制剂)。一抗孵育时间不足,建议4℃结合过夜,或者是由于二抗与一抗不匹配,选择针对一抗来源的种属的抗体。 洗膜过度,洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-2
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问
玻片测试时容易起雾,有好的方法吗?
天一湖医者
把盖玻片泡进酸性液体中,或者可以将盖玻片按压在平面木头上来回摩擦。于是雾便轻易地被木头磨掉了。而且不用担心盖玻片是不是会被刮花,因为玻璃的硬度大于木头。
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问
慢病毒液一定要浓缩吗?
一条咸鱼_
要,通常需要浓缩病毒颗粒以获得高滴度,特别是需要感染大量细胞或者用于某些对转导具有抵抗力的细胞系时。
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