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问
我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB?
Dfcaizjm
转膜200mA转40min封闭时间稍微长点
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问
一个化学2类新药,需要进行哪几期临床试验?(1、2、3、4期)
whilt-shirt
上市前1、2、3期试验都是需要,4期为上市后评价
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问
wb检测,投稿时是不是不能剪膜?
whilt-shirt
这个看杂志要求,有的杂志要求整张膜,有的不要求
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问
细胞中NFKB和AKT蛋白表达低但磷酸化水平高,可以说明两个蛋白被激活了吗?
whilt-shirt
是的,只要磷酸化水平比上非磷酸化蛋白水平的值升高就能说明被激活了
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问
做wb时,一个细胞过表达某种蛋白,这个细胞的总蛋白会发生变化吗?
天一湖医者
一般来讲会发生变化,一个细胞过表达某种蛋白,这个细胞的总蛋白会发生变化。
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问
真核生物表达,验证质粒连接目的基因问题
Eason老歌迷
你用的是哪一种毕赤酵母菌株。毕赤酵母宿主菌常用的菌株类型有四种,分别是X33、 GS115 、 KM71H 、 SMD116。GS115 菌株具有 AOX1 基因,属于 Mut+ ,指的是甲醇利用正常型; KM71 H 菌株的 AOX1 位点被 ARG4 基因插入,属于 Muts ,指甲醇利用缓慢型,两种菌株都适用于一般的酵母转化方法 。不同的菌株验证方法也不一样。
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问
如果WB实验中需要检测的蛋白是牛乳蛋白,封闭液该怎么选呢?
天一湖医者
TBST进行稀释获得5%的牛奶封闭液(5g/100mL)
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问
出现多条条带时怎么处理?
申东熙老伯
可以适当稀释一抗,降低一抗浓度。
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问
转染有些细胞能转进有些细胞转不进
bamboopiggy
建议你配成mix以后,同时转hela和293看看,是不是因为质粒的原因,还是你在配置mix过程中,有遗漏
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问
多巴染色大概要孵育多久?看文献甚至孵育了十几个小时这样的情况下多巴很容易氧化标变质。
天一湖医者
一般是37度孵育4小时就可以了。
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问
关于WB原始数据的问题
秋秋欣欣
现在也没有要求提供整张膜啊,只是需要显影的白光对照,如果整张膜的话可以混合孵育抗体
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问
通透是否会影响细胞膜表面蛋白染色?
whilt-shirt
会有点影响,有可能会导致膜蛋白染色效果变差
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问
提完蛋白之后跑聚丙烯酰胺凝胶电泳如何看蛋白质量如何
whilt-shirt
可以试试用考马斯亮蓝染一下试试
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问
pcr如何用NCBI设计引物?
bamboopiggy
ncbi主页右侧有个blast,点进去,然后往下拉,有一个primer blast,点进去,然后按照里面的要求填写就可以了
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问
WB蛋白裂解问题提问
汤姆卜丽波
我们用的也是这种。一般不会补加。可以不加
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问
文中提到用ncbi确定蛋白是内源还是外源,外源蛋白是不是全长序列;是否是二聚体或多聚体;等,想请问有人可以分享下查的具体指引吗?
wenfengzhu
内源性蛋白或外源性蛋白要看查询结果,直接在NCBI输入要查询的蛋白名称,最好为英文,看是自身表达,同源性基因表达出的为内源性蛋白,外来异物细胞免疫或体液免疫等出现的蛋白是外源性蛋白,此外,体外培养的,或者看和宿主是否有同源异质性,所谓同源性异质性物质,指同一种属的不同物质,有为内源,无为外源。从而确定是为内源还是外源,还要看它们的氨基酸组成,以及连接氨基酸的肽键,看是否有基团的末端切除或丢失,从而
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问
动物随机分组简便操作?
sophomore
先打耳标,记好每只动物编号,用excel或spss软件参照随机数模型建立个随机数分组就行。
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问
细胞敲低过表达问题咨询
bamboopiggy
做转录因子和下游靶基因的关系,应该用chip或者是luciferase实验来验证,不是敲低和过表达来验证的。
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问
rtPCR结果分析
Eason老歌迷
1、如果有标准曲线,按照标准曲线计算;2、一般都是相对量,则用delta delta CT方法来计算;3、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性;4、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起;5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据,CT值一般在35左右就失去参考价值了,平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。
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问
DpnI酶切后电转,为什么还会有质粒转进去
bamboopiggy
DpnI 酶切后,最好胶回收纯化一下,再电转
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