实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问蛋白水解度测定，如何操作？

天一湖医者

蛋白水解度测定，常用方法是茚三酮法，利用待测蛋白样品完全水解液做为茚三酮比色的标准样品测定蛋白质的水解度。水解度（ Degree of hydrolysis，DH）代表水解过程中蛋白质肽键被裂解的程度，常用百分数来表示：DH =h/htot× 100%式中，h是水解后每克蛋白质被裂解的肽键数，毫摩尔数（mmol/g）。htot是每克原蛋白质中的肽键毫摩尔数（mmol/g），注意，当蛋白质特指时h

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问蛋白三维建模，相关求助？

Eason老歌迷

某个基因某处发生了6个碱基重复，导致氨基酸序列中的2个氨基酸重复，这样可以三维建模说明致病性。

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问求助重组蛋白的酶活性测定问题

天一湖医者

如果你有正确构想的有活性的高纯度酶，可以将你重组表达的酶和有活性的酶做个CD 看它们的高级结构是否一致！如果没有有活性的酶，很难知道你表达的酶的构想是否正确，即便是知道他的AA序列。一般的高级结构预测软件是在已知AA序列的情况下预测它可能的三级结构，与该实际的存在形式没有直接联系

1 回答522 围观

问酵母双杂交，蛋白互作?

Eason老歌迷

是不是你的转化率太低啊?)检测感受态细胞效率，标准操作规范。注意质粒使用量，检查仪器状态。重新配制新鲜培养基，并做对照转化。

1 回答608 围观

问蛋白纯化时发现沉淀出现问题？

Eason老歌迷

硫酸铵沉淀是很粗的分级方法，建议你精纯的话还是要过柱子的。

4 回答515 围观

问蛋白在纯化时，如何定量？

Eason老歌迷

蛋白质含量方法常见的有以下四种。根据物理性质：紫外分光光度法。据化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法、胶体金法。根据染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。根据其他性质：荧光法。我们实验室更喜欢用考马斯亮蓝染色法。

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问有人知道做体外蛋白修饰抗体法验证时，考马斯亮蓝染色的作用？

Eason老歌迷

做体外蛋白修饰抗体法验证时，考马斯亮蓝染色的作用: 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝在酸性条件下为棕红色，其所含的疏水基团在酸性条件下雨蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在5

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问帮忙判断是否污染，Hela贴壁细胞镜下有很多不明小点

天一湖医者

应该是支原体污染，可以看到细胞中有很多空泡样改变。

3 回答1029 围观

问WB做内参，显影是没有条带

Eason老歌迷

显影没有条带，可能是几个原因，可能是显影操作问题，也可能是是切胶切错了，也可能是你封闭没有封闭好。

3 回答1747 围观

问wb背景高：有黑点；怎么办

Eason老歌迷

背景脏，可能是因为，你的封闭时间有点短，也可能是你的抗体浓度有点高。

4 回答685 围观

问基因敲除结束后再进行回补，获得的回补菌株没有恢复到原先的水平怎么解释？

Eason老歌迷

要特别注意做回补的时候，移码突变的必须要做cDNA突变，就是同义突变，将CRISPR识别的PAM序列去掉才行，要不然，回补的cDNA也会被切割破坏掉。注意移码突变的过程中，有一定概率出现的WB背景杂带的问题比较麻烦。回补之后的序列可能会干扰到回补片段的表达鉴定。

1 回答2368 围观

问请问细胞在无血清高糖培养基环境中合成酪蛋白的时间大约能维持多久？

Eason老歌迷

这个要看你的细胞数量和状态，一般高于24h。

1 回答285 围观

问神经干细胞具有多向分化和更新的潜能吗？

Eason老歌迷

具有多向分化和更新的潜能。干细胞是存在于机体内的一类具有无限自我更新复制以及多向分化潜能的细胞群体。

2 回答474 围观

问zea Longa评分法是在拔栓前还是拔栓后

Eason老歌迷

一般是插完2个小时，拔出线栓大概1cm后，就可以评分了。

2 回答685 围观

问如何添加CUMS噪声和电刺激？

Eason老歌迷

有专门的实验仪器，每个牌子的设置都不太一样。拿我们实验室的来举例吧，需要电流、电压：0.1A，36V，设定放电刺激T1时间为10秒，间隔T2时间为5秒，自动循环刺激。设置方式如下：按下刺激仪上方红色按钮，手动调整电流,到0.1A，再次按下刺激仪上方红色按钮，手动调整电压到36V。长按设置键，再按动上下键，模式调整到P-6，短按设置键调整T1时间到10，再次短按设置键，调整T2时间到5，再次短按设置

2 回答467 围观

问原代成纤维细胞传代后飘了好多黑色团块培养基清澈但仔细看有流沙样

Eason老歌迷

感觉还是传代时消化过头，以至于细胞老化（胞浆出现明显黑色颗粒是细胞老化的标志），现在我采取的消化传代方法是：1，先用PBS细两遍，以去除残余血清对胰酶消化的影响2，加适量胰酶（以能铺满瓶底为宜），镜下观察见饱体回缩时即倒去胰酶3，利用剩下的一点点胰酶再消化，此时可以放入37度温箱中4，隔半分钟到一分钟将细胞拿出，侧拍瓶壁（用力），镜下可见细胞基本都已掉下来，此时可以加含血清培养基中和，再用吸管吹

3 回答2475 围观

问蛋白质和壳聚糖静电结合

Eason老歌迷

它两都发生反应形成复合物了，肯定在280的吸光度下降啊。壳聚糖的游离氨基与蛋白质羧基端的游离羧基在相关酶的催化下脱去一分子水形成肽键，形成以壳聚糖为辅基的蛋白质或壳聚糖-蛋白质复合物。

1 回答161 围观

问碱性磷酸酶染色不上色是怎么回事呀

Eason老歌迷

你可以试一试偶氮偶联法。方法很简单: 固定,4%PFA 15min RT，1XPBS洗涤,后即可加染液，染液的配方: Fast red 25mg，a-磷酸萘酚钠 5mg，10%Mgcl2 0.3ml，4.5%Borax液 5ml，dH2O 44.6ml。然后室温孵育,镜下观察结果,待达到理想染色后即洗涤。

1 回答436 围观

问WB一抗保存问题，我们实验室买的碧云天一抗稀释液，稀释后，4℃保存一抗，但是发现一抗用2周就不好用了，有什么办法可以延长一抗使用

sophomore

稀释后如果当时不准备用，一定放在-20℃中。否则一抗肯定会受影响。或者就是现用现配。

7 回答7564 围观

问请问大家24孔板爬片怎么能把细胞铺均匀呢？

hy-cell

用移液枪打匀后就轻轻放回培养箱静置，不要晃，开关培养箱也轻手轻脚

4 回答2002 围观

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