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科研学霸天团，48小时有问必答

问如何准确进行细胞计数？比如获取准确数量的少量细胞。

huarenqiang5

在计数板上用显微镜自己数出来就可以获取准确数量的少量细胞。

3 回答335 围观

问悬浮细胞总是在孵抗体和洗的时候被冲掉，悬浮细胞做免疫荧光怎么固定；

土井挞克树

悬浮细胞固定：细胞长好后一定固定好，非常影响后面拍片，4% 多聚甲醛、甲醇、丙酮均是可选用的固定液，固定时间在 10-15 分钟即可。记得之前用PBS清洗一次；另外可以使用PDL处理过的玻片，效果还行，很少脱片。

3 回答1051 围观

问请问悬浮细胞的免疫荧光，用什么方法进行贴壁效果更好。

靶点科技

建议使用靶点科技的悬浮细胞免疫荧光专用玻片。1.取对数生长期细胞，计数后，用PBS洗涤，调整到2-5百万细胞/ml。2.取150ul左右，加大约30万个细胞，滴加到玻片上。3.静止30分钟，不要超过一个小时。4.用PBS洗去没有固定牢固的细胞，就可以后续实验了

4 回答2290 围观

问细胞免疫荧光多色共染定位（靶蛋白有3个不包括dapi），推荐哪几种颜色

sswei

目前IF双标一般优先选择红色和绿色；如果是三标，则第三种颜色选择蓝色。

3 回答1887 围观

问共聚焦小皿固定以后细胞用pbs洗容易飘，有没有好一点的解决办法,2细胞本身转染了带mcherry的慢病毒，两个靶蛋白共定位的话选

huarenqiang5

建议爬片或者共聚焦皿用多聚赖氨酸和层粘连蛋白进行预处理。

3 回答1062 围观

问.能不能通过荧光或者激光共聚焦判断目标蛋白在不在细胞膜上？

sswei

可采用毛细管电泳-共聚焦激光诱导荧光技术检测单细胞中目标膜蛋白的检测方法。

3 回答165 围观

问染核蛋白的时候荧光全在胞浆里，核蛋白染不出来，但是之前染的时候荧光是在胞核里的。请问这是什么原因，如何改进

skyye

Triton X-100通透的时间和浓度是多少呢？可以适当提高浓度和延长通透时间

4 回答675 围观

问荧光淬灭太快（几秒钟就消失了还没来得及拍就全黑了）可能是什么原因呢？该怎么改进呢？

土井挞克树

可加防荧光淬灭剂，或者你速度快点以及在激光照的时候再拍照，不拍的时候移开玻片

3 回答2332 围观

问免疫荧光染色，两种抗原的共标率如何计算？

dxyc42u

可以使用流式细胞技术检测后上机分析

3 回答548 围观

问红色细胞膜荧光探针，总是染完之后在镜下看一片红，并没有像DAPI标记细胞核一样，完整标记细胞膜，不知跟什么原因有关系，怎么能改进

dxyc42u

考虑红色细胞膜荧光探针特异性有关

3 回答427 围观

问多颜色共同免疫荧光，最多选几个颜色，选哪些颜色的串色发生少？免疫荧光，或者激光共聚焦哪个好？

feixue7758527w

不知道最多选几个颜色，我所知道的实验大多就是两个染色的，最多也就是三个颜色，再多就不知道了。

3 回答592 围观

问烟草叶片共侵染结束后，为什么CFP和RFP只有RFP有信号?

dxyc42u

很有可能是CFP还没表达，可以延长检测时间看看，

3 回答361 围观

问组织成像时40倍物镜模糊，调整焦距不能解决，细胞40倍物镜就很清楚，什么原因？同一张片子，20倍物镜可以清晰，10倍物镜就茫茫一

feixue7758527w

我觉得还是你的片子切的太厚了，放大倍数越大，要求组织切片越薄，否则就是看不清的。

3 回答1464 围观

问偶联的兔源二抗单染在GFP通道下会有黄色荧光是为什么？在荧光双染时，如何避免或设计对照以排除荧光二抗串色带来的假阳性

dxyc42u

买牌子好一点的抗体就能避免这种情况

3 回答379 围观

问荧光染色拍照时 BW模式与伪彩或RGB模式该如何选择？

dxyc42u

我们一般选择BW模式拍的就很清楚了

3 回答853 围观

问观察切片免疫荧光时，正置荧光显微镜与倒置荧光显微镜该如何选择？

烧伤科常医生

观察切片的时候正置和倒置的都可以，观察细胞培养皿的时候一般用倒置的

5 回答1996 围观

问细胞器荧光成像很糊，调整聚焦参数无法改善，可能原因是什么？

huarenqiang5

考虑可能是焦距不对或抗原本身的原因。

4 回答735 围观

问如何很好地去染膜蛋白的免疫荧光？怎么保证染到的只是膜蛋白？

huarenqiang5

在洗涤过程中，一要注意动作轻柔，固定后的细胞比较脆弱，如果太过大力，很容易把细胞吹洗掉，二是洗涤时间要把握好，每次洗涤5min左右，三是切忌不要干片，即吸掉溶液后不要把细胞干着，不然容易造成背景着色。

4 回答767 围观

问调了很多参数，但组织的自发荧光仍然明显

dxyc42u

确定减少自发荧光的技术方法FFPE组织中产生的自发荧光很可能是由于C = C键或C = N键的存在。为了解决这一问题，有些研究，利用硼氢化钠来还原C = C和C = N键以减少组织的自发荧光。然而，硼氢化物和与之类似的还原剂在中性pH环境下很不稳定。研究人员发现，尽管硼氢化钠可成功的减少组织中的一些自发荧光，但该方法的可重现性低、试剂处理难度很大。

3 回答291 围观

问SIM成像时 1、荧光淬灭太快如何减少荧光淬灭，2、活细胞成像时SIM图像背景荧光太高如何调整。3、SIM成像如何调整曝光时间与

huarenqiang5

1.保持避光。2.减少曝光时间减弱光源强度。3.降低样品浓度。

3 回答853 围观

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