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        明胶酶谱法

        相关实验:明胶酶谱实验

        user-title

        dxy_jd8wveb3

        有没有大佬告知一下明胶酶谱法怎么做,按照知乎上的步骤做了两次做不出来,不知道原因何在

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        3 个回答

        user-title

        dxyc42u

        有帮助

        实验步骤

        1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

        2.次日收集上清液,将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min,-70℃储存备用。

        3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度(或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致)。与5×上样缓冲液混合,13ul样本+4ul上样缓冲液。(不要用枪用力吹打,防止出现过多气泡)

        4.配制分离胶和浓缩胶,16ul/孔上样(根据表达强度和蛋白浓度确定上样量),4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时(电泳时在周围敷上冰,有利于使条带跑直)。

        5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100,50mmol/L Tris -HCl ,5mmol/L CaCl2,pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。

        6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后,显示出MMP-2(72KD) 和MMP -9(92 KD)为位于蓝色背景上的透亮带,用凝胶图像分析系统分析读取条带面积,宽度和灰度值,做统计分析。

        注意事项:

        1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡 。

        2.明胶酶谱的活性受钙离子,锌离子,和PH值等因素的影响,因此缓冲液 配制应严格准确,尽量用超纯水,孵育温度也掌握好。

        3.用大梳子

        4.孵育液的PH最好在7.5-7.6,复性的TRITON时间长了会有絮状物,所以实验时尽量使用新鲜配置的。

        5.孵育的37度不要在CO2培养箱中,因为会改变孵育液的PH值,在普通孵箱即可。

        6.明胶要4度保存,配好后1周内使用

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

        user-title

        Dr_劉医生

        有帮助

        供参考的操作方案和注意事项:

        1. 收集生长对数期的癌细胞培养液。

        2. 将500μl培养液,45μl明胶琼脂糖颗粒(使用前混匀)和45μl平衡缓冲液混合均匀后加入微型旋转柱中,于旋转混合仪上平衡30min。

        3. 用洗涤缓冲液1洗涤琼脂糖颗粒,每次100μl洗涤3次,7000r/min离心除去洗涤缓冲液1。

        4. 用100μl洗涤缓冲液2洗涤琼脂糖颗粒1次,7000r/min离心除去洗涤缓冲液2。

        5. 向微型旋转柱中加入40μl的2x上样缓冲液,7000r/min离心。将离心后的上样缓冲液重新加入微型旋转柱中,于12000r/min离心10s。

        6. 采用8%分离胶在130V恒压下电泳2.5h。

        7. 用洗脱液在摇床上洗涤蛋白胶2次,各30min,除去胶中的SDS。

        8. 37℃孵育蛋白胶24h,使MMP分解明胶。

        9. 摇床上染色1h及脱色至条带清晰。

        10. 蛋白成像:用凝胶成像仪进行拍照。

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