如何设计质粒 求求各位大佬帮忙

采用重组酶构建质粒方法

1. 载体的制备一般推荐双酶切线性化，线性化完全，假阳性克隆低。酶切体系。

2. 对于使用重组方式连接来说，PCR 要设计引物, 设计引物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列，通过 PCR 扩增方式进行连接，PCR 的产物要纯化。

引物设计原则简单总结一下：

（1）前向引物：5’ 端--上游克隆载体末端同源序列+基因正向扩增引物--3’ 端

（2）反向引物：3’ 端--基因反向扩增引物+下游克隆载体末端同源序列--5’ 端

如果设计的基因特异插入片段扩增产物长度较长，可以选择 PCR 方式进行目的引物的扩增。

[可选 PCR 扩增体系]

ddH2O 14 ul

10 x Taq buffer 2 ul

10 um DNTP 1 ul

10 um primer F 0.5 ul

10 um primer R 0.5 ul

Vector 1 ul

Taq 酶 1 ul

[可选 PCR 扩增条件]

(1)95℃：5min

(2) 35cycle

95℃：30s

55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根 据引物TM值降低5度）

72℃：40s

(3)72℃：10min

(4)16℃：hold

PCR 扩增后，通过胶回收方式获得纯化的 PCR 产物。纯化后的 PCR 产物不需要进行酶切，直接用于重组反应。

3. 目的引物与线性载体进行重组反应。

[可选重组体系]

5 × CE II Buffer 4 μl

线性化克隆载体 50～200 ng

插入片段扩增产物 20～200 ng

Exnase® II 2 μl

ddH2O x ul

在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于 37 ℃ 反应 30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。重组效率在反应 30 min 左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率，这样大大减少了连接时间。

4. 转化

将连接产物转化到受体菌中（一般为 DH5a），涂板，培养过夜

5. 挑取单克隆，并鉴定

挑去平板上的单克隆培养，可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。

质粒设计是分子生物学实验中的关键步骤。以下是一些基本步骤和注意事项：

1.目标基因：首先，你需要确定你要克隆的目标基因。你需要在质粒上有这个基因的全长序列。

2.选择恰当的质粒：选择恰当的质粒载体也非常重要。这将取决于你的实验目标。例如，如果你想在真核生物中表达你的基因，你应该选择带有真核启动子和终止子的质粒。如果你的目标是在原核生物中表达，那么你需要一个带有原核表达系统的质粒。

3.限制酶位点：为了将目标基因插入质粒，你需要选择适当的限制酶切割位点。这些位点需要在质粒和目标基因两端都有。

4.选择合适的抗性标记：你需要选择一个合适的抗性标记来选择转化成功的细胞。

5.顺式作用元件：这些包括启动子、增强子、内含子、终止子等。它们控制基因的表达，选择和设计这些元件要基于你的实验需求。

关于如何设计顺式作用元件的序列，你需要对你要研究的生物的基因表达调控有深入的理解。顺式作用元件在不同的生物和细胞类型中可能会有不同的效应。

最后，对于质粒设计和克隆的进一步学习，有很多在线的资源和教程。比如，“Addgene”这个网站就有一整套关于质粒设计和使用的教程和资料。这个网站还提供了一个名为”SnapGene”的软件，该软件可以帮助设计和可视化质粒。

质粒构建

　　（1）质粒构建原理

　　质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

　　（2）质粒构建方式

　　质粒构建方式多样，常规的T4连接酶，下面就介绍下T4连接酶构建质粒方法，T4连接酶可用于平末端也可用于粘性末端连接，但一般推荐适用黏性末端。

　　（3）质粒载体的制备

　　质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

　　4.一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：

　　（1）选择质粒上两个酶切位点的距离不应小于太小（>10bp），否则影响限制性内切酶对切点的识别，不利于空载体的双酶切。

　　（2）一般目的基因用于克隆表达的情况下，酶切位点的选择要考虑到：

　　目的基因片段内部不含有所选的酶切位点（不然鉴定阳性重组子双酶切时会将目的基因切断）。

　　（3）实验后继应用的所有载体（真核、原核、酵母、昆虫）都尽可能含有所选的酶切位点。并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）。（不然换载体表达时，还要重新设计引物，以引进新的酶切位点）。

　　（4）尽可能选比较常用的酶切位点（常用切点酶的价格比较便宜）。

　　（5）两个酶切点至少隔上3个碱基。

　　（6）两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。

　　（7）最好使用酶切效率高的酶。

　　（8）最好使用双酶切有共同buffer的酶。