石蜡切片免疫组化实验

石蜡切片免疫组化实验
由上海乔羽生物提供，仅供参考！

主要试剂
染色缸；染色架；保湿盒；晾片盘；微量移液器；0.2MPBS，乙醇，二甲苯，BSA，中性树胶等

实验步骤
1. 石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟；
2. 脱蜡和水化：二甲苯(10min)→二甲苯(10min)→无水乙醇(5min×2次)→95%乙醇(5min×2)→90%(5min)→85%乙醇(5min) →80%乙醇(5min) →75%乙醇(5min)；
3. 蒸馏水冲洗2次5min；
4. 加3%H2O2孵育30min(室温)；
5. 蒸馏水洗2次；
6. 抗原修复：高压修复或微波修复。柠檬酸修复液：柠檬酸0.4g 柠檬酸钠3g配成1000ml。高压修复：高压2min；微波修复：预热5min，高火4min，中火5min；
7. PBS洗3次各5min，封闭30min；
8. 滴加一抗，4℃过夜或37℃孵育2~3h；
9. PBS冲洗3次各5min；
10. 滴加二抗，37℃孵育30~60min；
11. PBS洗3次各5min；
12. DAB显色，自来水充分冲洗；
13. 苏木素复染，自来水充分冲洗；
14. 脱水、透明各5~10min；
15. 封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。

免疫组化石蜡切片保存：
对 于石蜡切片，一般把它放在四度冰箱里，你的片盒外面最好包两层塑料袋，系紧，起一密封作用。等你要做实验的时候，拿出来后不要立刻打开它，等它自然恢复至 室温，然后打开片盒。这样做的目的就是防止切片变湿。即使这样，切片放置的时间也不要太长，有时间就快做了。如果切片是放在室温状况下，那保存的时间应该 更短了，我们的经验是室温放置的切片时间一长就不出结果。
冰冻切片的保存。如果你是要做漂染，你的切片就应该放在原来的固定液中，四度可以保留一个月，如果你是贴片的话，切片就应该保存在-20度的冰箱中，这样可以保存一段时间，千万不能让它干燥！

石蜡切片免疫组化实验—快速酶免疫组化二步法

实验原理：
根 据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。实验材料 石蜡切试剂、试剂盒 PBS柠檬酸盐缓冲液蒸馏水增强剂酶标抗鼠 兔聚合物苏木素酒精二甲苯树胶盐酸二氨基联苯胺仪器、耗材 烘箱微波盒塑料切片架显微镜胶头滴管实验步骤
1. 石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。
2. 取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处 理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具 体情况而定）
3. 每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。
4. 除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。
5. PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。
6. 除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。
7. 除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二氨基联苯胺），显微镜下观察5分钟。
8. 苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。展开 其他 一、特点：
1. 在切片加上一抗后，第二抗体标记多聚螯合物酶（HRP）的复合物与一抗结合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信号有显著的放大，其敏感性较SABC、SP法高。
2. 由于多聚物在体内不存在，又不使用生物素，从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。
3. 辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上，替代传统方法的 二抗、三抗，减少了实验步骤，且试剂孵育时间短，只需15分钟，使得免疫组化方法更简单，实验时间比SABC、SP法大为缩短。