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石蜡切片多重荧光免疫组化实验外
企业认证
暇步康生物
mIHC
张
操作流程:
1石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ。取出放在通风厨内,酒精晾干后放入自来水中稍洗,蒸馏水洗。
2抗原修复:组织切片置于盛满PH 9.0 EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复(也可以用高压1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他热修复方法)。中火8min,停火8min,转中低火7min,此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定)。
3阻断内源性过氧化物酶:切片放入3%过氧化氢溶液,室温避光孵育15 min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。
4BSA封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走),在圈内滴加用3%BSA-PBS(或者其他封闭液)均匀覆盖组织,室温封闭30min。
5加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X,切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37度1-2h。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
6加hrp二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织,避光室温孵育50min,PBS洗三次。
7荧光染料反应:TYRXXX荧光染料反应 2min-15min,PBS洗三次。
8重复2-7步骤(换用另外一种TYRXXX荧光染料)
9DAPI复染细胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。
10封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
11镜检拍照:切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。
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