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        免疫印迹与免疫检测实验

        实验分类:

        免疫学实验

        最新修订时间:

        简介

        免疫印迹(常称之为Western印迹),可用于检测单克隆或多克隆抗体识别的抗原。

        来源:丁香实验

        操作方法

        转移槽转印蛋白质

        1. 制备抗原样品,并用小型或标准尺寸的单向或双向凝胶分离蛋白,在一个或多个泳道中分离预染色或生物素酰化的蛋白质分子量标准。 2. 电泳完成后,拆卸凝胶夹层,去除积层胶。以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶30 min。 3. 将转移盒放入一个较大的托盘中,加入足量的能盖没整个转移盒的转移缓冲液。 4. 在塑料转移盒的底边,依次将下面物品组装转印夹层垫或海绵,一张剪切得如凝胶大小

        半干转移系统转印蛋白质

        1. 制备样品,并在小型或标准尺寸的单向或双向凝胶上分离蛋白质。 2. 准备转印膜 3. 拆卸凝胶夹层,除去积层胶。 4. 组装转印夹层: Mylar聚酯薄膜屏蔽物 3张以转移缓冲液饱和的滤纸 已平衡的转印膜 凝胶 3张以转移缓冲液饱和的滤纸 当每一组分往上堆叠时,需排除气泡。 5. 在转移夹层的顶部放置顶电极。 6

        第二抗体欧联物进行免疫检测

        1. 将膜放入可热密封的塑料袋,加5 ml 封闭液,密封塑料袋,在旋转摇床或摆动平台中摇动30~60 min。 2. 用封闭液稀释第一抗体(取决于抗体和检测系统,以1:10~1:100 000稀释)。 3. 打开袋子,倾去封阻液,以稀释的第一抗体工倾代替之。在室温下持续摇动30~60 min。 4. 带着手套从塑料袋子中取出膜,放在塑料盒子中摇动着用200

        亲和素-生物素偶联

        1. 在旋转摇床或摆动平台中持续摇动使膜与合适的封闭液平衡。对于硝酸纤维素膜或PVDF膜,需在室温封闭30~60 min。尼龙膜则需在37℃封闭2 h。 2. 用TTBS溶液(用于硝酸纤维素膜或PVDF膜)或TBS溶液(用于尼龙膜)稀释第一抗体。 3. 从封闭液中取出膜,放入第一抗体溶液中。于37℃缓慢摇动30 min。 4. 在TTBS或TBS中洗膜3次,毎次超过15 m

        发色底物显迹

        1. 在室温以PBS洗膜15 min 以去除过量的磷酸盐和Tween 20。 2. 将膜放入发色底物显迹液,条带应在10~30 min 内出现。 3. 用蒸馏水洗膜,终止反应。晾干后拍照留永久的记录。

        发光底物显迹

        1. 用50 ml 底物缓冲液洗膜两次以平衡膜,每次15 min。 2. 对于使用硝酸纤维素膜或PVDF膜进行的碱性磷酸酶反应:膜置于Nitro-Block溶液中5 min,然后以50 ml 底物缓冲液洗5 min。 3. 将膜移入显迹液中,浸泡30 s 或5 min。 4. 取出膜,滴干水份,将膜正面朝下放在一张透明的塑料保鲜膜上,向后折叠用保鲜膜将膜紧密包裹起来。

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