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        转移槽转印蛋白质

        相关实验:免疫印迹与免疫检测实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  制备抗原样品,并用小型或标准尺寸的单向或双向凝胶分离蛋白,在一个或多个泳道中分离预染色或生物素酰化的蛋白质分子量标准。

        2.  电泳完成后,拆卸凝胶夹层,去除积层胶。以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶30 min。

        3.  将转移盒放入一个较大的托盘中,加入足量的能盖没整个转移盒的转移缓冲液。
         
        4.  在塑料转移盒的底边,依次将下面物品组装转印夹层垫或海绵,一张剪切得如凝胶大小的滤纸,并预先以转移缓冲液湿润凝胶,用一试管或玻璃棒在凝胶表面缓慢滚动,以排去凝胶和滤纸间的气泡。
         
        转移槽转印蛋白质
        图一、利用转印槽进行免疫印迹
         
        5.  准备转印膜,按凝胶大小但各边都比凝胶大约1 mm 剪膜。成45地慢慢将凝胶放入蒸馏水中,水将会渗进膜中并润湿整个表面。然后在转移缓冲液中平衡10~15 min,PVDF膜短暂地在100%甲醇中放一下,然后在转移缓冲液中平衡10~15 min。

        6.  用转移缓冲液湿润凝胶表面,直接将已润湿的膜放在凝胶顶部,排去气泡。
         
        7.  润湿另一张Whatman 3MM 滤纸,并置于膜的阳极面,排去所有气泡,在滤纸的顶部放另一块Scotch-Brite垫或海绵。

        8.  将转移盒顶部的半面放置适当,扣紧,完成组装。
         
        9.  往转移槽中加入转移缓冲液,按正确的极性方向将转移盒放进电转仪中,连接电源。

        10.  在冷却条件下100 V 电转30~60 min,或在冷室中14 V 电转过夜,

        11.  关电源,拆卸转印装置,取出转印膜,并在膜上剪一小角或用软性铅笔或Paper-Mate笔作上标记定位。
         
        12.  凝胶用考马斯亮蓝染色以确定转移效率。需要时,也可将硝酸纤维素膜或PVDF膜以辅助方案提供的可逆染色方法使蛋白质显迹,也可用如考马斯亮蓝、印度墨墨汁、萘酚蓝或胶体金不可逆染色。

        13.  进行蛋白质的免疫杂交和显迹。

        来源:丁香实验

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