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实验问答25,172,904 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

全部

细胞

免疫

问双向免疫扩散实验怎么判断抗原蛋白相对浓度？

此用户已注销

当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。根据有否出现沉淀线，可用已知的抗体鉴定未知的抗原，或用已知的抗原鉴定未知的抗体。沉淀线靠近抗原孔，则提示抗体含量大；靠近抗体孔，则提示抗原含量较多；不出现沉淀线则表明抗体或抗原的缺乏或抗原过剩；另外，如出现多条沉淀线,则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，可用于鉴定抗原或抗体的纯度。

2 回答552 围观

问免疫荧光染色实验中，有时用甲醛进行固定时间较长可以得到更好的染色，有时较短染色效果更好，请问固定时间与蛋白质种类是否存在联系？

txs900416

取决于目的蛋白的性质，有时候固定时间太长，细胞膜表面分子容易变性脱落；有时候固定时间太短，固定不完全，染色效果不好

2 回答826 围观

问免疫荧光共定位量化一般采用哪个系数？

简单最重要666

皮尔逊相关系数和及重叠系数。两者作用关系仍然有所不同

2 回答3141 围观

问染色细胞质不清晰的原因是什么？

颜渊溪桥

如果你说的是荧光染色，除了实验操作外，一个可能是抗体特异性不够，另一个可能是细胞比较圆，不是很适合做染色观察，实验目的允许的情况下可以换成比较铺展的细胞做。

3 回答798 围观

问怎样减少非特意结合？抗体已定

今天摆烂了咩

抗体浓度过高也可能导致此问题降低抗体浓度，可以减少非特异性条带

3 回答371 围观

问所有底物在孵育之前都要避光吗？

yfcwyh

ELISA实验中，在酶标抗体孵育，以及显色底物孵育这两步建议避光，其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹，或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。

1 回答502 围观

问需要自己制备特异性抗体吗，得到抗体之后再怎么操作呢

小暮

一般自己做课题制备不了特异性抗体吧，特异性抗体不都是买文献介绍的吗？至于得到抗体后怎么操作看你要做什么实验吧，WB？ELASA？CHIP？都是看抗原和特异性抗体结合

1 回答446 围观

问一抗过程中无法足够一和目标蛋白结合 ? 细胞核显色不明显，靶细胞中没有目标蛋白? 切片本身脱蜡不彻底，如何解决?

郭郭的郭郭

1、洗涤不充分，膜没有洗干净。2、封闭不充分，一抗可能直接结合到膜上，造成二抗孵育时在非特异性位点发生结合。3、一抗/二抗浓度太高，出现非特异性结合。要解决封闭不充分这个问题，可尝试延长封闭时间，也可更换封闭液。常用的封闭剂有 5% 脱脂奶粉、5% BSA、血清和明胶等，推荐室温封闭 1 小时以减少背景。另外，脱脂奶粉常含有酪蛋白，由于酪蛋白会结合磷酸化抗体而易产生高背景。因此，检测磷酸化蛋白时建

2 回答280 围观

问二抗染坏了（非特结了），如何补救? 信号放大过度咋整? 染料和pbs在组织中互相作用的正确步骤?

dxywode

1) 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7．4)冲洗三次，每次3分钟(3×3’)。　　2) 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。　　3) 每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。　　4) PBS冲洗3×3’。　　5) 甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。　　6) 甩去血清

1 回答597 围观

问同一样品多次ELISA检测，测试结果差异大怎么解决？

peaceful13

样本的保存会影响蛋白的含量，尽量减少样本的反复冻融，并且测试时间间隔不可过长；其次elisa实验其实很多的是看样品含量趋势比较，如果要测试多次elisa实验的检测结果，那么最好有个校准的标品，再每次elisa实验时，校准产品检测出来的值差异需要在控制范围，这样确保实验间的差异变化也不过多影响最终样品值的确定

4 回答2186 围观

问用血清孵育过的细菌，不孵一抗，只用FITC标记的抗鼠的二抗孵育，当做阴性对照，阴性值特别高，请问是血清中的什么东西能与二抗反应吗

dxywode

免疫组化中的封闭血清，不能选择和一抗同源的，否则会出现假阳性；因为二抗会和血清中的Ig反应。而免疫组化的替代对照里，用的也是和实验一抗同源的血清，出来的结果理论上却应该是阴性的——说明阳性结果是与特异性抗体结合产生的，而不是血清中存在的。

1 回答551 围观

问如果是做多克隆抗体，是免疫兔子好还是免疫老鼠好呢？如果是免疫老鼠，对小白鼠的品种有要求吗？

郭郭的郭郭

多克隆抗体一般通过免疫接种合适的哺乳类动物而产生，例如小鼠、兔子或者山羊。通常更倾向于采用大型哺乳类动物，因为可以采集更多的血清。一般选择兔子比较多，如果是老鼠的话，对种类一般没有要求。

2 回答1185 围观

问石蜡切片抗体结合是否需要温箱孵育？

c_Yeats

1.一般一抗4℃过夜，二抗室温2.可以脱色后复染看看

2 回答611 围观

问流式细胞术检测NK细胞杀伤功能，如何精确检测杀伤效率。

txs900416

NK92细胞的杀伤功能取决于NK细胞的细胞状态及靶细胞的细胞状态，建议将细胞状态调整到一致再做重复实验。此外，合理标记靶细胞（例如使用CTV或CFSE染料）进行合理的靶细胞圈门可以区分效应细胞和靶细胞。杀伤时间和效靶比都需要预实验探索

2 回答1575 围观

问Western blot 中背景强

颜渊溪桥

1%t tween+5%peptone tbst/pbst 配置，室温封闭1h,铅笔标记下marker，会洗没的；含0.1%tween上抗体。

3 回答411 围观

问ELIISA全菌包被检某个蛋白的时候，阴性对照特别高，怎么办

郭郭的郭郭

ELISA的前带效应。前带效应（或后带效应）其实是由测量程序的固有属性产生。对于所有测量程序而言，都有分析测量区间（analytical measurement interval，AMI）这一个重要属性。两个思路：1. 优化测量程序，拓宽AMI，通过提高原料用量或者改进包被工艺，使目标浓度进入AMI以内；2. 建立稀释方案，通过稀释使目标浓度降至分析测量区间以内，再对其进行检测。第二种思路其实是在

2 回答726 围观

问做COIP实验，互作的两个蛋白在目标位置有条带，但是阴性对照（NC）在相同蛋白分子量的位置也出现了浅条带，是什么原因？怎么改善？

小暮

阴性不应该有条带，有条带就是有结合，这个说明抗体有非特异结合的可能：1.抗体特异性不够，如果反复多次阴性对照出现条带考虑，更换抗体。2.上样错误，仅表现一次阴性对照阳性，重复实验就行

3 回答579 围观

问免疫荧光中DAPI 信号过强甚至看不清细胞核轮廓和核仁是什么情况？

dxywode

1.组织切片太厚：这种情况下可以选择将组织切片变薄试试。2.封闭不佳:封闭的目的就是为了减少非特异性的结合，减少背景染色。如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间。

3 回答4106 围观

问Western Blot转膜失败是为什么

小暮

(1) 膜没有完全均匀湿透使用 100% methanol 浸透膜。(2) 靶蛋白分子量小于 10 000选择小孔径的膜，缩短转移时间。(3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液（pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液。(4) 甲醇浓度过高过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分

4 回答853 围观

问流式细胞术单细胞悬液制备如何获得更明显的分群？

txs900416

T细胞染色要看T细胞的富集程度，例如淋巴器官中，若不分群，主要考虑细胞量过大抗体量不足；若TIL或者其他组织中来源T细胞，还需要考虑细胞分离不好、T细胞丰度较低的因素，建议去除实质细胞背景，加染白细胞标志CD45，圈出cd45阳性细胞群再分析。

4 回答2795 围观

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