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科研学霸天团，48小时有问必答

问做小鼠基因型鉴定，条带要么不出要么出了杂带，换了很多primer，体系，裂解液。求问大神解救😭该咋办？

dxy_gwrp7ndq

可以考虑优化抽提方法，保证基因组DNA 质量。在PCR 反应体系中，基因组DNA 的浓度也会影响PCR 的效率。基因组DNA 过多或过少都有可能导致PCR 扩增失败。可以考虑调整PCR 反应体系。若PCR 鉴定出现非特异性条带，可以考虑提高退火温度，以提高引物的特异性结合。

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问多聚甲醛固定与丙酮固定的区别？

Amor良

1、这两种方法基本效果都还可以。但要注意多聚甲醛固定时间长的话，一定要防止抗原被醛基封闭决定族。2、其实，丙酮的作用原理是溶解膜磷脂，所有的脂质双层（胞膜、核膜、细胞器膜等）将被破坏，但蛋白和多糖类不受影响。而丙酮固定后不需进行抗原修复，它是一种非交联固定剂。3、多聚甲醛固定对酶类和脂类保护的好，易与蛋白发生交联，所以一般经过甲醛或PFA固定后的标本一般需要抗原修复。

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问污染的细胞怎么处理？可以挽救吗？

Guoood

细胞污染后一般很难救回来，加双抗救回来也很难保证细胞处理的效果，建议每次处理细胞都保证无菌操作，怕污染的话可以在细胞出现污染前加双抗预防。

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问细胞培养时能不能更换培养基的种类？

RC0628

每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供的培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

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问小鼠最大采血量是多少

小布丁瑶瑶

看情况以25g的成年小鼠为例，它的循环血量大约为1.8ml。以250g的成年大鼠为例，它的循环血量大约为16ml。

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问每次做的MTT结果都有点不太一样，但趋势是一样的，除了考虑铺细胞的问题，还可以是什么呢？

三昧骨科

铺细胞前的计数要准确。同时不知道你用的什么细胞，如果是细胞株的话和代就没有关系了。然后你每次用同样试剂的话，加试剂的枪是否准确啊，再就是和个人手法有关系。建议把数据拿给老师看一下，一般都需要重复多做几次的，排除一些不好的实验结果。如果趋势一样，但是最后值差的很多，建议同样条件下重复多做几次，毕竟实验就是需要反复重复的

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问单细胞测序如何学习分析

彭彭彭文

分亚群，第二步，寻找疾病mαrKer标志物，第三步，功能研究

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问跑蛋白的时候，蛋白条带很黑，请问如何解决？

vae1476

抗体特异性不高会导致这种情况，另外提高封闭时间有利于解决

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问nlrp3炎症小体激活后贴壁不牢，免疫荧光染色会冲掉怎么办？

府宅

洗的时候注意冲洗力度，如果吸头直接对着细胞并且吹打力度过大，的确能把细胞吸吹下来，尽量避免头直接对准细胞吧，建议贴着孔的侧壁加液体

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问新型冠状病毒康复后会有自身免疫嘛？

dxywode

新型冠状病毒肺炎的患者恢复后体内产生了抗体，这些抗体的滴度随着时间的推移，也有可能会逐渐的减弱，甚至是消失。所以对于既往有新型冠状病毒肺炎的患者，仍然需要采取措施加强防护，预防再次出现感染。

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问实验标本存在内源性干扰物怎样解决？

dxywode

（1）稀释标本：这在判断急性病原体感染的特异IgM抗体如抗HAVIgM，抗HBclgM， TORCH的IgM抗体检验等尤为有用。因为急性感染时，血循环中特异的IgM抗体滴度通常很高，而RF滴度通常相对要低得多。因此，在测定前对标本进行稀释，特异的IgM因高滴度存在仍可检出，而非特异的RF则会因为稀释变成非常低的滴度，从而对测定几乎不产生干扰。现在，有些特异IgM检测Elisa试剂盒不要求稀释标本，

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问板上的标曲的OD值都应该是成一个梯度上升的，为什么不管做了多少个板，板上标曲的最后一个孔的OD值反而低了

dxy_gwrp7ndq

如果两个平行孔的OD值相差太大的话，有可能你酶标板没有包被好！其实也跟实验过程人工误差有关的，尽量减少操作所产生的误差。每次加完样品要适当的震荡一下，保证抗原与抗体反应充分。

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问某一个抗体多次调整条件还是跑不出来，除了抗体本身的问题还可能是因为什么呢？

dxy_gwrp7ndq

可能原因及解决策略：1. 上样量较少,建议上到20ul-50ul看看;2. 分离胶改为12-15%;3. 提高一抗和二抗的浓度,建议提高1倍;4. 如有可能改为ECL法显色;5. 尽量使用分子量Marker来标记目的条带的正确位置.

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问染色质免疫共沉淀共沉淀实验中，验证十分沉淀目的DNA的特异性引物应该怎么设计？qpcr结果如何计算？

txs900416

引物设计原则还是参照pcr的引物设计原则，最好设计小片段的引物可以节省pcr的难度。模板应选用基因组上该基因的全系列，pcr的产物最好一边位于内含子区一边位于外显子区。chip的qpcr内参可选用一些现成的经过验证的ChIP-qPCR Control Primer Sets ，可以作为阴性对照引物或阳性对照引物直接使用，也省去各种检验的麻烦

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问Elisa实验本底颜色太重什么原因？

wuli猫宁

1、实验过程中洗涤不充分，洗后未拍干，样品观中其他成分残留或酶标记物残留解决办法：充分洗涤，静置15秒，彻底拍干。加样和加酶的拍板的滤纸应弃去不用，不要重复使用，以免被污染。2、样品稀释液污染解决办法：弃去稀释液，重新配置。3、没有正确封闭解决办法：在样品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间就知道这么多，求其他解答。

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问免疫组化怎么估计抗体的使用量？

府宅

一个组织最多50ul抗体足够了。甚至更少20-30ul也可以，而且一抗还可以回收利用。

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问请问免疫组化加热容易脱片怎么办呀？

府宅

1.自己做明胶防脱片2.买商品硅化的片子3.有正离子片子，是最好的防脱片

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问可以通过什么方法检测抗体是否适用于染色质免疫共沉淀？

dxy_gwrp7ndq

目的蛋白抗体有效性也是染色质免疫沉淀实验的关键因素。要选择高质量,高亲和力和高效价的抗体来进行实验。先做Western Blot来检验在染色质免疫沉淀实验条件下抗体是否能够和目的蛋白的抗原决定簇结合而免疫沉淀。当抗体不能有效识别交联中的目的蛋白时，可更换其他不同靶向抗原决定簇的抗体或者降低甲醛固定交联时间。

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问ELISA实验相关问题

dxy_gwrp7ndq

一般室温24h，但4度过夜确实是最好的，另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握井获得较好的效果

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问什么是核酸适配体？SELEX技术制备核酸适配体的原理是什么？

txs900416

核酸适配体（Aptamer）是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。SELEX技术即指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by

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