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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
ChIP实验中使用超声方法断裂染色质温度不易控制,可能会使蛋白变性,影响ChIP结果,有没有较好的优化方案?
dxywode
目前,市面上有很多打断仪器是可以持续控制温度在指定温度的。也就是说可以将温度控制在一个比较冷的环境中,这样可以减少你所说的蛋白质变性的可能。同时在打断时可以选择间断循环打断。就是可以减少打断的时间,增加打断的循环数,从而达到同样的打断效果和降低蛋白变性的可能性。
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问
跑western条带总是中间浅、两侧深的原因是什么?
whilt-shirt
是不是转膜没夹紧导致的,尝试更换新的转膜滤纸
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问
蛋白质分离纯化,用什么方法最好?
丁香粉猪猪
一、常用的破碎组织细胞的方法有: 1.机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2.渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3.反复冻融法 生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4.超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上
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问
酶联免疫吸附试验是敏感性很高的一项技术实验,实验过程有哪些需要注意的?与其他实验相比有什么优点?
府宅
注意事项:1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式,这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体,如纤维素、交联右旋糖苷、聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。2.包被所用的抗原必须是可溶性的,而且要求是优质和稳定的制剂,纯度和免疫原性要高。如果不纯,由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置,降低敏感性和特异性。此外还应考
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问
为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白?
邓豆豆逗
可能细胞表达量较少检测不到,建议换大皿培养,增加上样量,或者抗体浓度,还有可能确实没表达,重新诱导,同时用流式,elisa等同时检测
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问
湿转转膜时间与蛋白大小有没有必然联系呢?
迟C迟
有关系的,转膜时间太长,小蛋白会从膜中穿过。
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问
蛋白结构探索,什么是蛋白
小布丁瑶瑶
蛋白质结构是指蛋白质分子的空间结构。作为一类重要的生物大分子,蛋白质主要由碳、氢、氧、氮、硫等化学元素组成。所有蛋白质都是由20种不同的L型α氨基酸连接形成的多聚体,在形成蛋白质后,这些氨基酸又被称为残基。蛋白质和多肽之间的界限并不是很清晰,有人基于发挥功能性作用的结构域所需的残基数认为,若残基数少于40,就称之为多肽或肽。要发挥生物学功能,蛋白质需要正确折叠为一个特定构型,主要是通过大量的非共价
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问
怎么确定上样量呢?怎么计算?为什么WB条带会跑歪,那怎么处理呢?
府宅
这要根据你做的蛋白表达量多少,一般是用DAB显色要50-100μg,用ecl曝光上样量为20-40μg。但根据你蛋白表达量的不同目标蛋白绝对量DAB法至少50pg,ecl法至少20pg。
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问
RACE实验中,小胶跑的出来,胶回收却效果不理想怎么回事?
府宅
1)减少非特异性扩增。 2)增加目的片段的产量。
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问
为什么显影时,marker比条带还要显?
迟C迟
本来商业化的marker就更容易跑出明显的条带。目标条带淡说明目的蛋白少,可以调整上样量,marker少加点,目的蛋白多加点。
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问
wb内参不齐怎么调上样量
迟C迟
我们一般认为每个样品表达的管家基因(House Keeping)的量应该是一致的,用做内参检测应该是恒定不变的。其实不是,所以这里提示大家,如果检测某一个内参差异很大时,我们可以更换另一个内参检测!
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问
ChIP-seq和ChIP-ChIP相比有哪些优势?
府宅
ChIP-seq在样品数量方面比ChIP芯片更具优势,因为ChIP-seq需要更少的量。ChIP-seq产生更精确的蛋白质结合位点列表和转录因子,增强子和序列基序的鉴定。可以使用ChIP-seq分析染色质和组蛋白变体的核小体定位和翻译后修饰。这种分析尤其受益于增强的空间分辨率。
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问
请问wb和免疫组化用的抗体大多是通用的吗?说明书里要注意啥?
dxy_gwrp7ndq
一抗是否能够通用,还要看你购买的抗体说明书上是否标有IHC的字样。一般来说WB和IHC检测时候对一抗的要求是不同的,但是很多抗体也能通用,这是抗体生产厂家进行了检测。至于二抗,如果没有其他交叉反应,也是可以用于IHC的。
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问
chip-seq一般多少细胞满足要求?一般生物重复能做么?
迟C迟
可根据自己的实验设计,在开始实验前计算所需要的 ChIP 反应次数,准备相应足量的组织或细胞。因此,我们建议以⼀个样品组为标准,准备约 100 到 150 mg 组织样品(每个样品组能满⾜同时进⾏目的蛋白抗体、阴性对照 IgG、阳性对照 H3 抗体等多个 ChIP 反应的用量) 。
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问
蛋白浓度测定除了BSA方法,还有没有其他方法?
天一湖医者
还有紫外吸收法,双缩脲法,BCA方法,Lowry法,考马斯亮蓝法,凯氏定氮法等
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问
蛋白稀释梯度一般怎么设定
府宅
用考马斯亮蓝法时,稀释蛋白的倍数主要取决于标准曲线的情况。
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问
免疫荧光实验蛋白荧光太强,甚至形成非特异性的标记。背景染色无法区分阳性区域,怎么办?
dxy_gwrp7ndq
如果背景太强,可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间。可能是自体荧光,想知道组织是否有自体荧光,查看在非染色区域是否有荧光即可。有些自体荧光来自固定步骤,可以避免使用戊二醛固定,或者使用含0.1% 氢硼化钠的PBS洗涤以除去游离的醛基。还有些荧光来自内源性的荧光分子,可以用苏丹黑/硫酸铜进行光漂白。
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问
PBMC与肿瘤细胞共培养时,PBMC要如何预刺激?如果是用CD28包被的话是怎么包被的?
dxy_gwrp7ndq
可以购买 life technology公司生产的 Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 for T-Cell Expansion and Activation,货号:11131D,价格: 8011元/瓶。用这个试剂后就不用再包被单抗,也可以进行预刺激
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问
跑WB无法跑出满意的条带,怎么办呢?
府宅
1. 注意孵育、终止时间如果想得到漂亮的梯度条带,无论是不同处理时间的样品,还是不同给药浓度的样品,在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止,尤其是对于磷酸化蛋白,哪怕 1 秒也不要提前或耽搁。 2. 抑制蛋白降解这是样品制备中最需要注意的部分。抑制样品蛋白降解的方法主要有两种:(1) 使用蛋白酶抑制剂小编使用的是罗氏公司(Roche)的蛋白酶抑制剂 Cocktail 片剂,效果不
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问
哺乳动物表达系统主要用于制备哪种蛋白?
dxy_gwrp7ndq
已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子 VII 、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素III,集落刺激因子等。
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