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科研学霸天团，48小时有问必答

问RACE实验中，小胶跑的出来，胶回收却效果不理想怎么回事？

府宅

１）减少非特异性扩增。２）增加目的片段的产量。

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问为什么显影时，marker比条带还要显？

迟C迟

本来商业化的marker就更容易跑出明显的条带。目标条带淡说明目的蛋白少，可以调整上样量，marker少加点，目的蛋白多加点。

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问wb内参不齐怎么调上样量

迟C迟

我们一般认为每个样品表达的管家基因（House Keeping）的量应该是一致的，用做内参检测应该是恒定不变的。其实不是，所以这里提示大家，如果检测某一个内参差异很大时，我们可以更换另一个内参检测！

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问ChIP-seq和ChIP-ChIP相比有哪些优势？

府宅

ChIP-seq在样品数量方面比ChIP芯片更具优势，因为ChIP-seq需要更少的量。ChIP-seq产生更精确的蛋白质结合位点列表和转录因子，增强子和序列基序的鉴定。可以使用ChIP-seq分析染色质和组蛋白变体的核小体定位和翻译后修饰。这种分析尤其受益于增强的空间分辨率。

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问请问wb和免疫组化用的抗体大多是通用的吗？说明书里要注意啥？

dxy_gwrp7ndq

一抗是否能够通用，还要看你购买的抗体说明书上是否标有IHC的字样。一般来说WB和IHC检测时候对一抗的要求是不同的，但是很多抗体也能通用，这是抗体生产厂家进行了检测。至于二抗，如果没有其他交叉反应，也是可以用于IHC的。

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问chip-seq一般多少细胞满足要求？一般生物重复能做么？

迟C迟

可根据自己的实验设计，在开始实验前计算所需要的 ChIP 反应次数，准备相应足量的组织或细胞。因此，我们建议以⼀个样品组为标准，准备约 100 到 150 mg 组织样品(每个样品组能满⾜同时进⾏目的蛋白抗体、阴性对照 IgG、阳性对照 H3 抗体等多个 ChIP 反应的用量) 。

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问蛋白浓度测定除了BSA方法，还有没有其他方法？

天一湖医者

还有紫外吸收法，双缩脲法，BCA方法，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法等

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问蛋白稀释梯度一般怎么设定

府宅

用考马斯亮蓝法时，稀释蛋白的倍数主要取决于标准曲线的情况。

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问免疫荧光实验蛋白荧光太强，甚至形成非特异性的标记。背景染色无法区分阳性区域，怎么办？

dxy_gwrp7ndq

如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间。可能是自体荧光，想知道组织是否有自体荧光，查看在非染色区域是否有荧光即可。有些自体荧光来自固定步骤，可以避免使用戊二醛固定，或者使用含0.1% 氢硼化钠的PBS洗涤以除去游离的醛基。还有些荧光来自内源性的荧光分子，可以用苏丹黑/硫酸铜进行光漂白。

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问PBMC与肿瘤细胞共培养时，PBMC要如何预刺激？如果是用CD28包被的话是怎么包被的？

dxy_gwrp7ndq

可以购买 life technology公司生产的 Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 for T-Cell Expansion and Activation，货号：11131D，价格： 8011元/瓶。用这个试剂后就不用再包被单抗，也可以进行预刺激

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问跑WB无法跑出满意的条带，怎么办呢？

府宅

1. 注意孵育、终止时间如果想得到漂亮的梯度条带，无论是不同处理时间的样品，还是不同给药浓度的样品，在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止，尤其是对于磷酸化蛋白，哪怕 1 秒也不要提前或耽搁。 2. 抑制蛋白降解这是样品制备中最需要注意的部分。抑制样品蛋白降解的方法主要有两种：(1) 使用蛋白酶抑制剂小编使用的是罗氏公司（Roche）的蛋白酶抑制剂 Cocktail 片剂，效果不

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问哺乳动物表达系统主要用于制备哪种蛋白？

dxy_gwrp7ndq

已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子 VII 、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素III，集落刺激因子等。

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问做qpcr的时候要有什么操作注意事项

dxy_gwrp7ndq

1. 用于qPCR反应的RNA应避免DNA的污染，RNA提取和反转过程中应小心谨慎。2. 操作过程中避光，冰上操作。3. cDNA模板避免反复冻融，否则会引起模板的降解。4. 模板量不足或降解将导致CT值出现过晚或者不出现。对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。

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问免疫荧光细胞化学双重染鱼法中，两种一抗在混合稀释时怎么保证最终浓度？

dxywode

进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。换言之，混合后

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问免疫荧光我想染3种蛋白，需要准备哪些？抗体和试验鼠。

whilt-shirt

需要对应的抗体，相关的试剂，除DAPI以外的三种波长的二抗

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问血细胞吞噬实验总是失败，荧光染色后没有发现吞噬现象

vae1476

细胞吞噬实验对细胞活性和状态要求很高，需要进行细胞活力考察

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问Fluo4 AM检测细胞质内钙离子浓度，钙离子探针荧光微弱？

dxywode

Fluo-4 AM(钙离子荧光探针) 是配制于无水DMSO (anhydrous DMSO)中的储存母液，浓度为2mM。用于细胞内钙离子检测时，Fluo-4 AM的常用浓度为0.5-5 μM。通常用含有0.5-5μM的Fluo-4 AM的适当溶液和细胞一起在20-37℃孵育10-60分钟进行荧光探针装载，随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-4 AM在细胞内充分转变成

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问怎样提高免疫发光实验的效率？

wuli猫宁

一、细胞密度1、保证玻片上的细胞以单层细胞生长2、细胞生长速度3、保证爬片是无菌的二、孵育抗体1、一抗浓度过高；2、一抗孵育之后洗涤不充分；3、一抗特异性不高，这时候你要考虑这个蛋白是细胞本身就表达的还是转入的质粒表达的； 4、可以查一下抗体识别序列，看看是否有同源性的蛋白。三、DAPI复染细胞核四、封片

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问肺癌切片免疫组化的结果如何判读

dxy_gwrp7ndq

主要依靠其免疫组化作为重要的诊断依据，TTF-1、 NapsinA、CK7阳性，提示是肺腺癌。P40、P63、CK14阳性，提示是肺鳞状细胞癌。CgA、Syn、CD56阳性，提示是肺的神经内分泌肿瘤。上述所有的神经内分泌标记、腺癌的标记和鳞癌的标记都是阴性，则提示是肺的大细胞癌。判断免疫组化染色为弥漫强阳性的标准为，大于等于10%的肿瘤细胞阳性，信号定位准确，且被染成黄色或褐色颗粒。局灶阳性或弱阳

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问人肿瘤抗原的识别需要注意什么？

dxy_gwrp7ndq

收集细胞要迅速，低温下进行，以减弱蛋白酶的作用

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