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实验问答23,897,653 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

全部

细胞

免疫

问酶联免疫吸附试验是敏感性很高的一项技术实验，实验过程有哪些需要注意的？与其他实验相比有什么优点？

府宅

注意事项：1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。2.包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考

3 回答1275 围观

问为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？

邓豆豆逗

可能细胞表达量较少检测不到，建议换大皿培养，增加上样量，或者抗体浓度，还有可能确实没表达，重新诱导，同时用流式，elisa等同时检测

5 回答259 围观

问湿转转膜时间与蛋白大小有没有必然联系呢？

迟C迟

有关系的，转膜时间太长，小蛋白会从膜中穿过。

3 回答3212 围观

问蛋白结构探索，什么是蛋白

小布丁瑶瑶

蛋白质结构是指蛋白质分子的空间结构。作为一类重要的生物大分子，蛋白质主要由碳、氢、氧、氮、硫等化学元素组成。所有蛋白质都是由20种不同的L型α氨基酸连接形成的多聚体，在形成蛋白质后，这些氨基酸又被称为残基。蛋白质和多肽之间的界限并不是很清晰，有人基于发挥功能性作用的结构域所需的残基数认为，若残基数少于40，就称之为多肽或肽。要发挥生物学功能，蛋白质需要正确折叠为一个特定构型，主要是通过大量的非共价

3 回答485 围观

问怎么确定上样量呢？怎么计算？为什么WB条带会跑歪，那怎么处理呢？

府宅

这要根据你做的蛋白表达量多少，一般是用DAB显色要50-100μg，用ecl曝光上样量为20-40μg。但根据你蛋白表达量的不同目标蛋白绝对量DAB法至少50pg，ecl法至少20pg。

3 回答1687 围观

问RACE实验中，小胶跑的出来，胶回收却效果不理想怎么回事？

府宅

１）减少非特异性扩增。２）增加目的片段的产量。

3 回答518 围观

问为什么显影时，marker比条带还要显？

迟C迟

本来商业化的marker就更容易跑出明显的条带。目标条带淡说明目的蛋白少，可以调整上样量，marker少加点，目的蛋白多加点。

3 回答795 围观

问wb内参不齐怎么调上样量

迟C迟

我们一般认为每个样品表达的管家基因（House Keeping）的量应该是一致的，用做内参检测应该是恒定不变的。其实不是，所以这里提示大家，如果检测某一个内参差异很大时，我们可以更换另一个内参检测！

3 回答10555 围观

问ChIP-seq和ChIP-ChIP相比有哪些优势？

府宅

ChIP-seq在样品数量方面比ChIP芯片更具优势，因为ChIP-seq需要更少的量。ChIP-seq产生更精确的蛋白质结合位点列表和转录因子，增强子和序列基序的鉴定。可以使用ChIP-seq分析染色质和组蛋白变体的核小体定位和翻译后修饰。这种分析尤其受益于增强的空间分辨率。

3 回答1286 围观

问请问wb和免疫组化用的抗体大多是通用的吗？说明书里要注意啥？

dxy_gwrp7ndq

一抗是否能够通用，还要看你购买的抗体说明书上是否标有IHC的字样。一般来说WB和IHC检测时候对一抗的要求是不同的，但是很多抗体也能通用，这是抗体生产厂家进行了检测。至于二抗，如果没有其他交叉反应，也是可以用于IHC的。

3 回答1620 围观

问chip-seq一般多少细胞满足要求？一般生物重复能做么？

迟C迟

可根据自己的实验设计，在开始实验前计算所需要的 ChIP 反应次数，准备相应足量的组织或细胞。因此，我们建议以⼀个样品组为标准，准备约 100 到 150 mg 组织样品(每个样品组能满⾜同时进⾏目的蛋白抗体、阴性对照 IgG、阳性对照 H3 抗体等多个 ChIP 反应的用量) 。

3 回答1741 围观

问蛋白浓度测定除了BSA方法，还有没有其他方法？

天一湖医者

还有紫外吸收法，双缩脲法，BCA方法，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法等

4 回答651 围观

问蛋白稀释梯度一般怎么设定

府宅

用考马斯亮蓝法时，稀释蛋白的倍数主要取决于标准曲线的情况。

3 回答775 围观

问免疫荧光实验蛋白荧光太强，甚至形成非特异性的标记。背景染色无法区分阳性区域，怎么办？

dxy_gwrp7ndq

如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间。可能是自体荧光，想知道组织是否有自体荧光，查看在非染色区域是否有荧光即可。有些自体荧光来自固定步骤，可以避免使用戊二醛固定，或者使用含0.1% 氢硼化钠的PBS洗涤以除去游离的醛基。还有些荧光来自内源性的荧光分子，可以用苏丹黑/硫酸铜进行光漂白。

3 回答677 围观

问PBMC与肿瘤细胞共培养时，PBMC要如何预刺激？如果是用CD28包被的话是怎么包被的？

dxy_gwrp7ndq

可以购买 life technology公司生产的 Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 for T-Cell Expansion and Activation，货号：11131D，价格： 8011元/瓶。用这个试剂后就不用再包被单抗，也可以进行预刺激

3 回答1230 围观

问跑WB无法跑出满意的条带，怎么办呢？

府宅

1. 注意孵育、终止时间如果想得到漂亮的梯度条带，无论是不同处理时间的样品，还是不同给药浓度的样品，在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止，尤其是对于磷酸化蛋白，哪怕 1 秒也不要提前或耽搁。 2. 抑制蛋白降解这是样品制备中最需要注意的部分。抑制样品蛋白降解的方法主要有两种：(1) 使用蛋白酶抑制剂小编使用的是罗氏公司（Roche）的蛋白酶抑制剂 Cocktail 片剂，效果不

3 回答579 围观

问哺乳动物表达系统主要用于制备哪种蛋白？

dxy_gwrp7ndq

已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子 VII 、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素III，集落刺激因子等。

3 回答479 围观

问做qpcr的时候要有什么操作注意事项

dxy_gwrp7ndq

1. 用于qPCR反应的RNA应避免DNA的污染，RNA提取和反转过程中应小心谨慎。2. 操作过程中避光，冰上操作。3. cDNA模板避免反复冻融，否则会引起模板的降解。4. 模板量不足或降解将导致CT值出现过晚或者不出现。对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。

3 回答1026 围观

问免疫荧光细胞化学双重染鱼法中，两种一抗在混合稀释时怎么保证最终浓度？

dxywode

进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。换言之，混合后

3 回答2869 围观

问免疫荧光我想染3种蛋白，需要准备哪些？抗体和试验鼠。

whilt-shirt

需要对应的抗体，相关的试剂，除DAPI以外的三种波长的二抗

3 回答254 围观

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