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科研学霸天团，48小时有问必答

问 pull down实验使用的细胞不同会对实验有影响吗

土井挞克树

会有影响的，建议用同一种细胞，不然统计学上就会引起质疑

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问为什么所有试剂和检测样本要平衡至室温后再进行加样操作

huarenqiang5

因为这样试剂和检测样本的稳定性好，利于实验，使实验结果更精准。

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问切片用H2O2处理的目的是什么？

sswei

为了去除过氧化氢酶，影响DAB染色。

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问说明书上说一抗孵育可以是37度2小时，也可以采用4度过夜，那我到底应该采用哪种方法呢？

沫子大大

其实这两种方案我都试过，差异性不是很大。但我染的是小胶质细胞，你的具体情况不了解，你可以根据你的时间安排，算是当做摸条件，但结果差异性应该不是很大。

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问用FITC和用Cy3标记的二抗除了在颜色上有区分外，其他方面还有区别吗？比如说特异性和敏感性方面。

huarenqiang5

FITC和Cy3各自标记的二抗主要是在颜色上区别较大，而在特异性和敏感性没有大的区别。

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问我的组织就是肝组织，含有很多内源性的生物素，由于亲和素会与生物体内的内源性生物素反应，从而有非特异性着色，如何解决？

sswei

封闭内源性生物素：将组织切片用0．0l％亲和素溶液室温处理10～20分钟，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。也可购买生物素阻断剂试剂盒，其中A液为亲和素．B液为生物素。使用时加A液l滴，室温10分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟；加B液1滴。室温10分钟．PBS冲洗3次，每次2分钟。

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问在实验中，特别是在修复后切片容易脱片，切片脱片的原因是什么？

申东熙老伯

切片脱片可能是抗原修复时未等待修复液完全恢复到室温就封闭或者抗原修复时在修复液离泡太久。

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问免疫组化检测时，如何控制显色背景？

huarenqiang5

1、每一步一定要充分清洗，做细胞培养片子时，要避免冲洗液直接冲到细胞上，以防将细胞冲走。2、控制好DAB染色时间，最好在显微镜下控制时间，在我们的实验过程中，发现DAB染色时间与书上描写的（要求5-15分钟）差异很大，一般120秒就开始变色，时间过长将出现明显的假阳性结果。3、一抗的浓度不能太高,否则会竞争性拮抗.但也不能太低,每次冲洗要把水吸干,否则会人为地降低浓度。4、一抗如果是单抗的话，建议

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问大佬们，southern blot 结合标记探针为什么还要染色

sswei

EB染色剂可以用来检测单链或双链核酸(DNA或RNA)。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小,所以其荧光产率也相对较低。

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问一个抗体做WB和IP没问题，条带很强，但是IHC没信号。而且我做IHC时同步做了另一个抗体的，信号很强，可能的原因是什么呢？

sswei

无信号-阴性结果1、真阴性结果：组织或细胞不表达抗原，无法检测到相应信号;或抗原表达量太低，无法检测到相关信号。2、假阴性结果（1）免疫组化染色前错误：切片时选错蜡块和拿错切片，这种情况可用H&E染色验证。（2）免疫组化染色操作错误：①确认是否忽略了应加的某种试剂，包括一抗抗、底物等。②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否在足够的温度条件下解音了足够的时间。③复查抗体的标签确认是否使用

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问做免疫荧光时用到的免疫电镜的相关问题？

sswei

是为了更好地观测到DNA分子的超微结构。

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问请问诱导用的IL-4是人源的还是鼠源的？

huarenqiang5

诱导用的IL-4人源和鼠源的都可以。自己可以根据实验目的和要求进行选择。

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问免疫荧光实验问题求助？

huarenqiang5

你的这个情况建议最好还是重新做为好。

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问求助免疫荧光实验的问题？

心细北方

用PBS多洗几遍应该好一些，楼主可以试试！

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问请教病人组织蜡块切片后存放在条件

申东熙老伯

切片最好放在四度冰箱，两三个月应该是没问题的。

4 回答2399 围观

问免疫组化的问题求助？

sswei

DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就被覆盖，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。

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问BM–DC好难诱导条件摸了无数次

sswei

有许多方法可进行。Lutz法与Son法相似，均可大量制备BMDC。Lutz法与Inaba经典方法和Son法的最大不同是使用细菌培养皿（Petri dish）而非细胞培养板来培养骨髓细胞。Ⅰnaba法是细菌培养皿不容易使骨髓中的巨噬细胞贴壁，从而抑制巨噬细胞的发育，进而避免巨噬细胞对DC成熟的抑制作用，这可能是该法能够以较低铺板密度获得大量 BMDC 的主要原因。但该法的培养时间较长，需要10-

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问如何分离外周血NK细胞和单核细胞

土井挞克树

目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异最多12天，但需要刺激。

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问做免疫荧光的玻片怎么处理才比较好呢？为什么放入玻片爬片后就染菌了呢？

申东熙老伯

可以用免洗的细胞爬片做免疫荧光，如果不是免洗的玻片可以在使用之前用镊子夹着过一遍火。

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问磁珠分选和流式分选中对细胞的处理过程有什么不同？

土井挞克树

流式分选需要先制备单细胞悬液，然后染色才能进行分选

4 回答276 围观

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