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        枯草芽孢杆菌电转

        相关实验:电转化流程

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        我都emo了

        有做过将质粒电转进枯草芽孢杆菌感受态细胞中的友友们吗?有问题想请教,买了商品化的BS168感受态,质粒抗性是红霉素,抗性板浓度为10ug/ml,电转仪用的是BTX,电转条件为2.5KV/2.25KV,200欧,25uF,但是没长出菌,想问问做过的友友们哪里需要改进。

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        3 个回答

        user-title

        灵枢天问

        有帮助

        电转不长菌有很多原因可能是你机器电压没调好所以没转上,也可能是感受态细胞状态不好了,或者是质粒抗性和平板不一致

        user-title

        汤姆卜丽波

        有帮助

        电压设置可以调大一点,还有就是质粒是测序过得么,要保证质粒没问题

        user-title

        你好几和户

        有帮助

        有以下方案,老师对照一下

        枯草芽孢杆菌电转化方案
        1 感受态细胞的制备
        1.1 从新鲜培养的平板上接种一单菌落至3 ml B2液体培养基中,试管(17×100 mm)。
        1.2 250 rpm,37℃培养过夜(16 h)。
        1.3 接种1.5 ml过夜培养的种子至150 ml(装于1L的三角瓶中)新鲜的B2培养基中,200 rpm,37℃培养,至菌数达到~1×108 cells/ml。
        1.4 将菌液冰水浴15 min,然后转移至250 ml的离心杯中,12,000 g,5 min,4℃离心收集菌体。
        1.5 吸去上清,菌体保持在冰水浴中。
        1.6 用250 ml冰冷的无菌水重新垂悬菌体,然后12,000 g,5 min,4℃离心去上清。应该用250 ml的无菌水洗涤2次以上。
        1.7 将洗涤后的菌体垂悬于25 ml冰冷的10%的甘油中,转移至30 ml的离心管中,12,000 g,5 min,4℃离心去上清。
        1.8 重新将菌体沉淀垂悬于2 ml 10%的甘油之中,细胞浓度~1×1010 cells/ml。
        1.9 将感受态细胞分装于1.5 ml的离心管中,每份250 ul,超低温速冻之后,于-70℃保藏。可以保持几个月不失效。
        2 电转化
        2.1 在一个1.5 ml的离心管中加入DNA样品(5 ng~2 ug,~3 ul)。
        2.2 室温下几分钟的时间融化感受态细胞,然后在加好DNA样品的管子中各加入50 ul感受态细胞,抽吸几次混匀。
        2.3 室温下温育30 min。
        2.4 设置仪器参数。
        2.5 将菌体转移到0.2 cm狭缝的电转化杯中,轻弹几下杯子让样品沉到底部。装好杯子。
        2.6 电击一次。
        2.7 电击完毕取出杯子并立即加入1 ml SMMP溶液(含有亚浓度的相应抗生素)。温和地将其转移至试管(17×100 mm)中,37℃,250 rpm,复苏 1h。
        2.8 查看和记录电击参数,时间常数应该在2.5 ms左右,记录场强(kV/cm)。
        2.9 涂布相应的LB抗性平板,37℃培养36~48 h。

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