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        不连续的蔗糖密度梯度纯化外泌体离心后不分层

        相关实验:蛋白质的分离纯化

        user-title

        雨中蝶舞

        大家好,之前根据文献的protocal做到纯化这一步,用20mM的trisbase配制不同浓度蔗糖浓度梯度(8%w/v,30%,45%,60%),在离心中加不同蔗糖浓度时可以看见分层,100000g离心2h后分层消失,求助版内各位大神蔗糖纯化这一步需要怎么操作呀?因为这个太费时间而且还没摸索出来,拜托啦

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        2 个回答

        user-title

        Dr_劉医生

        有帮助

        蔗糖密度梯度离心法是目前提取外泌体应用较多的方法,将细胞混合悬液或匀浆置于蔗糖介质的顶部,通过离心力的作用使细胞分层、分离,将外泌体从混杂物质中分离出来,然后使用滤膜进一步纯化(具体步骤见图)。蔗糖密度梯度离心法获取的外泌体纯度高,已作为药物载体用于临床试验。但前期准备工作繁琐,操作复杂耗时长,获得的外泌体数量却不多,而且可能会因梯度溶液高渗而导致亚细胞水分丢失,进而影响外泌体的生物学功能。这两篇关于提取纯化外泌体的中英文综述可以去详细阅读

        [1] 外泌体分离和纯化方法研究进展 中华检验医学杂志, 2021,44(2) : 167-170

        [2] Chen J, Li P, Zhang T, et al. Review on Strategiaes and Technologies for Exosome Isolation and Purification[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022,9.图片描述

        user-title

        汤姆卜丽波

        有帮助

        蔗糖梯度纯化法实验

        实验材料:染色质粗品

        试剂、试剂盒:聚碳酸酯离心管

        仪器、耗材:Dounce 匀浆器

        实验步骤:

        1. 准备两种 18ml,浓度分别为 20% 和 60% 的蔗糖分离缓冲液(聚胺,水相或己二醇法的缓冲液),然后以线性形式加到一 50 ml 的聚碳酸酯离心管中,用梯度生成器形成沿离心管的密度梯度。

        2. 将染色质粗品溶液轻轻地加到梯度上,用带吊桶式转头的 JS-13 ( Beckman Instruments ) 或 HB-4 ( Sorvall) 离心机在 2500 g 离心 15 分钟。

        3. 3 ml —份轻轻地从梯度顶部取出样品,取少量用相差显微镜检查染色质的存在情况。

        4. 收集含染色体的组分在 3000 g 离心 10 分钟。

        5. 用大约为起始染色体粗品溶液体积 1/30 的分离缓冲液重悬浮染色体,继续下一步研究。

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