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科研学霸天团,48小时有问必答
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WB有内参没目的会是蛋白降解吗?
申东熙老伯
蛋白降解的话内参应该也跑不出来,单纯降解目的条带的情况有点罕见,更考虑是蛋白样品存放和实验操作的问题。
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问
wb收细胞有什么好用的方法吗?
huarenqiang5
可以少加RIPA,或者把贴臂细胞消化下来后取细胞沉淀再加裂解液,看能否提高浓度,能杂出条带就有希望,每次都做内参,同一张膜做。
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问
脾脏样品提取蛋白或者RNA注意事项
huarenqiang5
在冷冻条件下碾磨组织,再快速匀浆,能有效灭活核酶。但如果裂解液太粘稠 (因为核酸含量高的缘故),PCI 抽提不能有效分层;加入更多裂解液可以解决此问题。多次PCI抽提可以去除更多残留的 DNA。如果加入醇后马上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。溶解后用酸性 PCI 再次抽提,可以去除 DNA 污染。
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问
WB内参蛋白跑不好
土井挞克树
内参差距太大的一个原因就是在蛋白定量环节出现了问题。另外条带有拖带,说明变性都没变性好,样本里有沉淀产生,最后一个中间出现了反白现象,说明二抗的浓度也高了,显色时间也没控制好,底物都被消耗完了
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问
PCR和western blot差异表达求助
genecreate
q PCR和WB不一致的现象很常见。mRNA到蛋白质之间有多个调控环节
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问
WB背景较深,非特异性杂带很多,科研小白求助各位大神!
wildC8OG
延长封闭时间,降低一抗浓度,增加二抗浓度
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问
急求园内大佬,有没有人做过活性氧流式的,请问一下数据怎么处理啊?
土井挞克树
双峰就是有的细胞染上染料了,有的没有染上所以双峰..
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问
弯弯的蛋白胶是咋回事捏
balalaLy
凝固时间太久太干了,或者跑胶的过程受热了
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问
Wb制备分离胶有问题,想请教一下大佬!
土井挞克树
15kd选用12%的胶就可以。
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问
wgs检测
此用户已注销
华大基因三到五天就可以查结果。
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问
CoIP选用什么蛋白标签比较好,为什么?蛋白标签的碱基序列是什么?
汤姆卜丽波
比较常用的有Flag标签,序列是(DYKDDDDK )
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问
內源性coip最少细胞用量与最大细胞用量,细胞量太大会不会造成非特异性结合
NatureBios
CO-IP的样本量会根据蛋白丰度有些偏差,做wb,通常细胞数量在10的六次方以上,定量后每个泳道20ug样本,非特异情形可以先用磁珠protein A处理下样本,再开始往下做
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问
蛋白免疫印迹常用的标签有哪些?如何选择?
NatureBios
标签有HIS HA FLAG GST GFP RFP mCherry等会在蛋白表达时插入到表达体系中,Western blot常用的内参有actin GAPDH Tubulin,针对样本核浆膜提取的样本,也有相应的蛋白做内参
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问
流动性中有的有机溶剂是色谱级的还需要过滤和超声吗? 超纯水机出的超纯水有电导率显示,需要过滤和超声吗?
徐彩云6
样品溶液亦必须用0.45μm的微孔滤膜过滤后才能进样。
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问
二抗用Fc包板还是Fab包板的效果不同,是什么原因?
此用户已注销
Fab段包含完整的可变区,以及恒定区的CH1区域。Fc段仅指Ig恒定区CH2和CH3的区域,相当于Y字结构下面那一部分。
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问
待测样品在进行ELISA检测中进行梯度稀释,测得的吸光度值如何转用IC50值的图表显示?
dxy_n1mn00tr
用测得的吸光度值,和浓度一一对应,作出模拟曲线,得出线性关系,就可用线性曲线方程得出IC50值。
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问
ELISA实验可以使用1%的明胶溶液做封闭液吗?,明胶可以做抗体稀释液吗?
徐彩云6
明胶可以做稀释液,其配制方法是:明胶0.1g+洗涤液100ml。
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问
求助| GST标签目的蛋白难吸附上beads怎么办?吸附效率低怎么办?
此用户已注销
可能原因1:洗脱缓冲液的体积太少 解决办法1:增加洗脱缓冲液的体积。 可能原因2:洗脱缓冲液的pH过低 解决办法2:调节洗脱缓冲液pH值至8-9 。 可能原因3:洗脱的时间不够 解决办法3:增加洗脱缓冲液与磁珠反应的时间。
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问
WB上样到60ug内参还是很浅,目的条带出不来
土井挞克树
你把可能性基本都排除了那就是细胞的问题
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问
有没有做过慢病毒转染thp-1细胞构建敲低稳转株?跪求指导?
徐彩云6
你这个需要离心后才能进行下一步操作
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