WB上样到60ug内参还是很浅，目的条带出不来
随心飞5YP2
各位站友，实验出现奇怪的现象，实在是想不通，求帮助！我用的细胞是中性粒细胞，大约2×1undefined6个细胞做一个组最后提取蛋白，测得的浓度不低，加40ul裂解液的情况浓度约在8ug/ul左右，上样量从18-60ug内参都特别浅，下图是上样60ug的图，内参很浅，目的条带出不来。
我首先排除操作的问题，做WB1年多了，操作上没有问题，做其他细胞的时候都正常。
其次排除抗体的问题，用其他细胞做的同批实验，抗体都是一样的，结果显示内参，目的条带都正常。所以抗体没有问题。
也排除裂解不充分的问题，应用超声破碎，再在冰上裂解30分钟和不用超声破碎结果差不多。
所以我考虑是不是细胞的问题，只有中性粒细胞出现这样的问题，可是都是一样的操作，提蛋白测出的浓度也不低，怎么就会出现这样的问题？实在是想不明白。有没有哪位好心人知道，求指导！！！
5 个回答
balalaLy
40ul裂解液裂解后浓度8ug/ul，我们一般用6孔板提蛋白加200ul裂解液，蛋白浓度1-2ug/ul是比较合适的。所以我觉得是不是你提蛋白的过程裂解液加太少了，而且你也说连内参也是很浅。
随心飞5YP2
裂解液再多加的话浓度会越低，这样上样的时候上的量更小，就更不会出结果呀
秋秋欣欣
那这样的话应该就是你的细胞问题了，重提一次看你细胞操作这一步的问题还是细胞本身的问题
随心飞5YP2
重复了很多次都一样，如果真是细胞的问题有解决的办法吗？
徐彩云6
是否是蛋白酶将蛋白降解了？或是SD序列问题？
随心飞5YP2
提蛋白的时候加了蛋白酶抑制剂了
huarenqiang5
也得考虑一抗浓度过高及二抗HRP催化活力是否太强？
随心飞5YP2
试过降低抗体浓度，也是一样的结果
土井挞克树
你把可能性基本都排除了那就是细胞的问题
随心飞5YP2
如果是细胞的问题有解决的办法吗？
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