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科研学霸天团，48小时有问必答

问蛋白组学检测到的差异蛋白为什么western blot检测不到？

百泰派克-李工

蛋白组学通过质谱等技术检测到的差异蛋白在Western Blot中检测不到可能有几个原因：1.检测灵敏度不同：质谱等蛋白组学方法通常比Western Blot更敏感，能检测到低丰度的蛋白。2.靶蛋白特异性：Western Blot依赖特异性抗体识别目标蛋白，如果抗体对该蛋白的识别性不好或者抗体质量问题，可能导致检测不到。3.蛋白修饰和变体：某些蛋白在体内可能经过翻译后修饰或存在不同的剪接变体，这些

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问WB的泳道背景比较黑，接近灰色是为什么啊？

百泰派克-李工

Western blot泳道背景变黑或接近灰色通常是由于以下几个原因造成的：1.过度曝光：如果曝光时间太长，胶片或成像系统可能会捕捉到过多的信号，导致背景变暗。2.膜处理不当：在转移或阻断步骤中，如果膜处理不当，比如阻断不充分，可能会导致非特异性结合，使背景变暗。3.抗体浓度过高：主抗体或次抗体浓度过高也会增加背景信号。4.洗涤不充分：如果洗涤步骤不充分，残留的抗体或检测试剂可能会增加背景。解决这

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问如何用考马斯亮蓝检测蛋白质的浓度？

sswei

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.

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问marker上4ul，显影目的蛋白没有条带（marker左图，标准品右图，标准品1ng和10ng）？目的蛋白标准品上样量多少合适，

周末也要努力呀

一般30微克左右，表达量低的要50-80微克，根据结果条带深浅调整

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问关于转录组与代谢组差异筛选

土井挞克树

一般在样本量不足或者样本量不均等的时候需要调整p值

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问ris-Glycine凝胶，Bis-Tris(MOPS)凝胶，Bis-Tris(MES)凝胶、在电源时如何选择、他们的原理是什么

土井挞克树

Bis-Tris 类凝胶系统是一种预制聚丙烯酰胺小型凝胶系统，可对非变性蛋白和蛋白复合物进行灵敏的高分辨率分析、分子量估算和纯度评估Bis-Tris 凝胶的工作原理在 SDS-PAGE 中，SDS 充当电荷转移分子，它可以让蛋白带净负电荷，从而使蛋白变性并向阳极迁移。BN PAGE 采用考马斯 G-250 染料作为电荷转移分子，该染料附着在蛋白上使其带净负电荷，同时保持蛋白处于非变性、天然状态。N

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问Western blot出现不规则斑点

huarenqiang5

主要考虑以下几点原因:1.封闭液没有完全溶解。2.封闭液和抗体发生作用。3.hrp偶联二抗有聚集体。4.发生细菌污染。

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问请教大家：氨基酸类的神经递质在大鼠外周血清和脊髓的变化趋势会是一样的吗

周末也要努力呀

理论上是一致的，但是由于释放到外清过程中会有损耗，会造成外周与实际不符的情况。

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问小分子蛋白（10KD）WB实验电泳液中不加SDS，但是wb不就是依靠SDS聚丙烯凝胶电泳的吗？如果不加SDS，是用tris填平吗

百泰派克-李工

小分子蛋白（10KD）在进行Western Blot（WB）实验时，通常确实使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。SDS是一种表面活性剂，它的作用是使蛋白质变性并赋予蛋白质负电荷，使蛋白质按照大小进行分离。如果你在电泳过程中不加SDS，蛋白质将不会完全变性，这意味着蛋白质的电泳迁移不仅受到它们大小的影响，还受到它们的形状和电荷的影响。这种情况下通常使用的是非变性电泳，或称为天然电泳。在

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问wb目的条带连成一条，内参正常，可能原因

百泰派克-李工

如果您的 WB（Western Blot）目的条带连成一条，但内参正常，可能的原因包括：1.过度加载样本：如果您加载的目标蛋白质样本过多，它们的条带可能会连成一条，因此请确保加载适量的样本。2.抗体亲和力过强或浓度过高：使用的一抗或二抗过于亲和或浓度设置得过高，导致过度染色。3.过度迁移时间：迁移时间过长可能会导致条带的扩散和连成一条，因此请确保迁移时间适当。4.蛋白质浓度不均匀：如果样本中的目标

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问请问有什么好的线粒体内参抗体VDAC1推荐？

土井挞克树

线粒体定位蛋白：VDAC1（抗电压依赖性阴离子通道蛋白）、COX IV（细胞色素C氧化酶）等

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问原来可以表达的蛋白现在诱导表达不出来了，请问有没有同学遇到相似的问题，最后怎么解决的？感谢！

dxy_qqfjs3aq

请问你解决了吗？我最近也遇到了一模一样的问题？

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问转录组学与代谢组学联合分析

sswei

基于“参与同一生物过程中的基因或代谢物具有相同或相似的变化规律”。以相同生物学意义为基础，通过代谢组数据获得重要差异代谢物或重要代谢通路，联合转录组数据鉴定出重要代谢通路上发生变化的目标基因。或者从转录组数据入手，经过差异分析获取大量差异基因，再结合代谢组数据，快速鉴定代谢相关的差异功能基因。基于表达量的分析策略更加多样：a）：根据差异代谢物和差异基因表达量，利用"spearman"算法对差异的基

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问小分子蛋白（10KD）WB实验电泳液中不加SDS是可行的吗?如果不加SDS，那电泳液的配方是？

huarenqiang5

小分子蛋白电泳液中不需要加SDS。

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问请问WB时出现这种单泳道背景特别黑是什么原因呀？图1。其他的条带是整个背景都很黑，用5%牛奶，5%BSA，和10%牛奶都试过了

周末也要努力呀

增加封闭时间和洗涤次数。也可能是抗体不行了，重新配置。还有配牛奶的时候提前配置摇匀冰箱里放一会再封闭

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问细胞培养液中蛋白富集方法！我表达的蛋白是分泌蛋白，但是直接做Western检测不到目的蛋白的产生，请问有什么方法收集上清液中蛋白

高山云初

收集上清比较简单，直接把上清收到离心管里，离心一下去掉细胞什么的，再用超滤管浓缩一下上清，不然的话上清还是太稀了。

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问WB半干转15V1.5h转蛋白失败原因？（pvdf膜已激活/顺序没错/目的蛋白11—14kd/marker一点没转上/装置OK）

土井挞克树

可能是时间太短的缘故，建议延长时间至2h

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问二维电泳为什么可以将不同种类的蛋白质进行高分辨率的分离？

小小翻车鱼

在等电聚焦阶段，蛋白质首先按照它们的等电点（pI）进行分离。等电点是指蛋白质电荷为零的状态。不同种类的蛋白质具有不同的pI值，因此可以通过调整pH梯度使得蛋白质在电场中的迁移位置达到各自的等电点，进而实现分离。在IEF阶段之后，蛋白质进一步按照分子质量进行分离。在这一阶段，蛋白质与SDS（十二烷基硫酸钠）结合，使得蛋白质带上负电荷，并按照分子质量的大小进行分离。SDS-PAGE利用聚丙烯酰胺凝胶进

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问western blot条带是沙状、由点构成请问是怎么回事？

土井挞克树

封闭不足，背景存在污染，建议多冲洗几遍

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问cited species是什么意思，也是可以发生发硬的种属吗

土井挞克树

是可以发生免疫应答的种属，一般用作抗体比较多

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