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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
WB一抗二抗配好后4℃保存能多久?一个月怎么样?
我是金博士
1、一抗4度可以在一周左右,加一点NaN3二抗现用现配!且不可加NaN3丽春红不会影响,染完直接封闭,封闭后丽春红就没了。2、一抗是什么?二抗还需要孵育过夜?3、先把内参做好
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问
为什么 WB 实验的目的条带总是多条?
ptosir
可能性1.你曝光的时候胶片或膜之间发生了轻微的错动;2.蛋白有部分降解;3.抗体与杂蛋白有非特异性结合,恰好杂蛋白分子量和目的蛋白分子量相近;4.蛋白出现了部分降解;如果以上可能性都排除了的话,恭喜你,很有可能发现了目的蛋白的蛋白修饰条带。当目的蛋白在细胞内有磷酸化、乙酰化等修饰存在时会产生卫星条带。
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问
制作下层凝胶后,用异丁醇封闭,可否用其他代替,比如正丁醇或水?
我是金博士
正丁醇、乙醇都是可以的,我们以前就用过。水就不行了。
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问
为什么 IP 样品条带位置总和 Input 条带位置不一致?
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问
WB 实验结果为什么出现了多条带?
tao0129
一抗、或二抗抗体浓度太高,多克隆抗体本身的非特异性反应,抗体的特异性不强,目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化,所以严格意义上说,内参是必须做的。
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问
显影时背景很黑,我就洗了两天膜,然后又显影了一次,这次是白片?
我是金博士
最好stripping一下,背景很黑的话需要调整一下二抗浓度。
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问
WB 实验中如何运用凝胶成像系统照相?加完二抗用 TBST 洗之后该做什么准备?
a5055778
洗完膜加上显色体系后,放在塑料薄膜里,轻轻推去气泡,然后直接放到照相系统里照相就可以了,系统会让你选多久曝光一次和照几张相,我一般选1min-5min/5-10张;假如你选1min一次,共照5次,那么总共就是5min,选一张最好的。复制下来再用CS analyzer之类的反色 输出图片就行了。
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问
请问为什么我提蛋白的时候蛋白浓度总是很低?
joson12345
可以少加RIPA,或者把贴臂细胞消化下来后取细胞沉淀再加裂解液,看能否提高浓度,能杂出条带就有希望,每次都做内参,同一张膜做,看下趋势是否还是随机。
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问
western blot
Sharty
可以不需要裂解,能电泳,电泳上样缓冲液中的SDS含量也足够裂解了。
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问
为什么同一批次提取蛋白跑出的条带不一致?
我是金博士
理论上实验结果是可重复的,你是不是操作上有不一致的地方呢?
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问
分泌蛋白量比较少且培养基中盐离子很多的情况下,如何能快速达到除盐和浓缩的目的?
xzw113
可以在血清饥饿后加入叠氮钠0.1%,防止蛋白降解,也可用cooktail,这个比较贵呵呵。然后用蛋白浓缩管富集milipore 有买的买10kd富集的就可以
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问
为什么 WB 做出来是白色的条带?
应用场景
二抗浓度或者目的条带丰富过高,很快消耗了底物,所以形成了白色条带
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问
求助western blot非特异条带非常多
hw26904636
我感觉抗体原因很重要。封闭1个小时应该够了。一抗孵育选择4度摇床过夜可以减少非特异性的表达
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问
请问如何得到纯化的目的蛋白?
detaibio
一般来说,蛋白质表达纯化中常见的蛋白挂柱洗不下来的情况有以下几点:1.蛋白本身疏水性强,容易沉淀。2.溶液中离子强度有点高(降低溶液中的离子强度)3.溶液的PH值低(提高溶液的PH值)把蛋白弄下来的办法有,关健是看你后继想用蛋白做什么。
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问
蛋白诱导表达量低,并且检测不出活性是怎么回事?
我是金博士
这个问题很常见,能表达出蛋白不容易,表达出的蛋白有活性也不容易。不过不用太着急,可以试着从这几个方面着手: 1、首先要确定是否有目的蛋白条带,是否落在理论大小处。这个可以通过SDS-PAGE来观察。2、如果表达量低,建议优化表达条件,比如改变温度,诱导剂浓度等。然后将蛋白纯化后再测酶活。3、没有活性还有一个可能是你的活性检测方法不对,这个需要你结合实验室基础或者文献来修缮,没有固定的方法。
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问
如何从悬浮细胞中提取蛋白质?
云天昊
将细胞悬浮液收集后先离心,然后加裂解液裂解
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问
WB高背景问题求助
极客医生
如果显色液 确定没问题 考虑下 胶本身的问题 和 封闭液不太好
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问
SDS PAGE 蛋白质变性了吗?如果是,为什么可以结合变性了的蛋白?
奇妙能力g
1,转膜时候,自动复性? 2,,一抗结合的是线性表位?
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问
western blot 背景深哪位大神知道这种水泡样的背景怎么去除
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问
WB曝光出来白色条带?
极客医生
如果是用的ECL话,可能是信号太强了
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