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问
WB 实验结果为什么出现了多条带?
tao0129
一抗、或二抗抗体浓度太高,多克隆抗体本身的非特异性反应,抗体的特异性不强,目的蛋白经过处理后发生变化,而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力,表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化,所以严格意义上说,内参是必须做的。
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问
显影时背景很黑,我就洗了两天膜,然后又显影了一次,这次是白片?
我是金博士
最好stripping一下,背景很黑的话需要调整一下二抗浓度。
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问
WB 实验中如何运用凝胶成像系统照相?加完二抗用 TBST 洗之后该做什么准备?
a5055778
洗完膜加上显色体系后,放在塑料薄膜里,轻轻推去气泡,然后直接放到照相系统里照相就可以了,系统会让你选多久曝光一次和照几张相,我一般选1min-5min/5-10张;假如你选1min一次,共照5次,那么总共就是5min,选一张最好的。复制下来再用CS analyzer之类的反色 输出图片就行了。
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问
请问为什么我提蛋白的时候蛋白浓度总是很低?
joson12345
可以少加RIPA,或者把贴臂细胞消化下来后取细胞沉淀再加裂解液,看能否提高浓度,能杂出条带就有希望,每次都做内参,同一张膜做,看下趋势是否还是随机。
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问
western blot
Sharty
可以不需要裂解,能电泳,电泳上样缓冲液中的SDS含量也足够裂解了。
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问
为什么同一批次提取蛋白跑出的条带不一致?
我是金博士
理论上实验结果是可重复的,你是不是操作上有不一致的地方呢?
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问
分泌蛋白量比较少且培养基中盐离子很多的情况下,如何能快速达到除盐和浓缩的目的?
xzw113
可以在血清饥饿后加入叠氮钠0.1%,防止蛋白降解,也可用cooktail,这个比较贵呵呵。然后用蛋白浓缩管富集milipore 有买的买10kd富集的就可以
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问
为什么 WB 做出来是白色的条带?
应用场景
二抗浓度或者目的条带丰富过高,很快消耗了底物,所以形成了白色条带
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问
求助western blot非特异条带非常多
hw26904636
我感觉抗体原因很重要。封闭1个小时应该够了。一抗孵育选择4度摇床过夜可以减少非特异性的表达
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问
请问如何得到纯化的目的蛋白?
detaibio
一般来说,蛋白质表达纯化中常见的蛋白挂柱洗不下来的情况有以下几点:1.蛋白本身疏水性强,容易沉淀。2.溶液中离子强度有点高(降低溶液中的离子强度)3.溶液的PH值低(提高溶液的PH值)把蛋白弄下来的办法有,关健是看你后继想用蛋白做什么。
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问
蛋白诱导表达量低,并且检测不出活性是怎么回事?
我是金博士
这个问题很常见,能表达出蛋白不容易,表达出的蛋白有活性也不容易。不过不用太着急,可以试着从这几个方面着手: 1、首先要确定是否有目的蛋白条带,是否落在理论大小处。这个可以通过SDS-PAGE来观察。2、如果表达量低,建议优化表达条件,比如改变温度,诱导剂浓度等。然后将蛋白纯化后再测酶活。3、没有活性还有一个可能是你的活性检测方法不对,这个需要你结合实验室基础或者文献来修缮,没有固定的方法。
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问
如何从悬浮细胞中提取蛋白质?
云天昊
将细胞悬浮液收集后先离心,然后加裂解液裂解
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问
WB高背景问题求助
极客医生
如果显色液 确定没问题 考虑下 胶本身的问题 和 封闭液不太好
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问
SDS PAGE 蛋白质变性了吗?如果是,为什么可以结合变性了的蛋白?
奇妙能力g
1,转膜时候,自动复性? 2,,一抗结合的是线性表位?
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问
western blot 背景深哪位大神知道这种水泡样的背景怎么去除
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问
WB曝光出来白色条带?
极客医生
如果是用的ECL话,可能是信号太强了
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问
为什么我曝光的结果胶卷是黑的条带是亮的?这是内参的条带?以前有人出现这样的结果吗?
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问
膜片钳是一个监测技术的概念,还是一个监测器械的概念?
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问
15kd 湿转半小时会不会转过头?
糖guo
如果害怕转过了,可以尝试放两张膜来转,前后两张都显影,看看结果。
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问
为什么我转完膜后,膜上没有任何条带,连 marker 条带都没有?
tobepan
连marker都没有?1.考虑转膜液的问题,是否过期失效?是否加甲醇?是否在低温条件下进行转膜?2.考虑转膜装置的问题。黑面在下,依次是海绵垫,滤纸,凝胶,PVDF 膜(膜一定要和胶贴好,不要有气泡),滤纸,海绵垫。3.转膜条件设置是否合理。我们实验室条件是 200mA,90min。供你参考。
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