实验问答21,887,120 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问曝光图上可以看到非特异性吸附很多，MARKER 也出现了条带，请问怎样可以改变该现象？

我是金博士

一抗用1:1000，二抗用1:5000试试。

1 回答3107 围观

问我用 CST 的 eNOS 一抗，RIPA(强)提取人脐静脉内皮细胞，做了几次了也一直没出来条带？

我是金博士

eNOS 这个不是很好做，呵呵内参做的很好？转膜后丽春红染膜了吗

1 回答881 围观

问蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

赵栋2012

ptglab战友回答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过。

1 回答2304 围观

问求问 2Xlaemmli sample buffer 怎么配制？

liona_lin

1. Sample Buffer, Laemmli 2× Concentrate:Solution contains 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0.004% bromphenol blue and 0.125 M Tris HCl, pH approx. 6.8.2. SDS gel-loading buffer (2X) 100 m

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问目的带做出来了，但是为什么膜的内参一直都没跑出来？

我是金博士

1、样品中无内参蛋白表达。 2、内参不能识别你检测的种属的样品？

1 回答2002 围观

问请问客养的小分子量蛋白的转膜条件 OK 吗？

xuxian1225

完全可以，我做的蛋白就是11k的，100V转120分钟都没问题，90分钟对这么小的蛋白足够了。

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问SD 大鼠的心肌标本，一抗二抗如何选择？

我是金博士

一抗选择能与你的种属来源起交叉反应的二抗选择：如果一抗来源是小鼠，二抗选择什么抗小鼠，以此类推。

1 回答1625 围观

问Native Page 为什么样品的下段都不见蛋白条带？

我是金博士

你的胶做得不太好啊，marker都分不开。你要是想知道条带少，是上样量少了还是降解了，可以做个上样量梯度，一般都会做个预实验，看看浓度。

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问为什么 WB 实验的目的蛋白发的很慢，而且不太清楚？

我是金博士

1、发光慢，可以考虑换用Millipore的ECL2、15孔上样量有限制，大了会串孔

1 回答1220 围观

问蛋白提取总是出现问题？

我是金博士

1、50-100ul，看细胞沉淀的多少而定2、细胞太少了？细胞中DNA含量比较大，如果有条件，用超声处理一下就好了

1 回答1681 围观

问WB 实验中为什么我的条带会跑得比正常的窄？

赵栋2012

drake015战友回答1. 可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀。2. 是不是有窄有宽？可能与你拔梳子的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3. 可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带

1 回答2760 围观

问WB 实验中二抗用 TBST 稀释液是否容易出现杂带？

我是金博士

1、稀释液可以放在4度，但是不建议超过一周2、回收的不能超过一周，如果超过一周放到-20冻存。我们都不回收的3、我们用BSA4、二抗还回收呢？我们从来不回收。为什么用TBST稀释会容易出现杂带？5、胶片比膜大6、用剪刀剪

1 回答8520 围观

问胶片定影之后显得有点暗，不够清亮是不是定影液的问题呢？

我是金博士

显影液的问题，10%与12%的胶跑出来的marker位置是不一样的。

1 回答570 围观

问做目的蛋白时压出来都是白板，不知道为什么？会是目的蛋白的一抗有问题吗？

我是金博士

1、调整一下GAPDH一抗的浓度，试试1:10000,20000另外二抗也可能会带出杂带，你可以做一个不加GAPDH一抗，其他均加入的对照。2、这个不能直接断定一抗有问题吧，先确定你的系统是稳定再考虑一抗问题。

1 回答996 围观

问WB 结果的内参非常好，既没有背景条带也亮，而目的就不行，不是没有条带就是背景很高，这又是什么原因呀？

我是金博士

1、任何一个公司的抗体都不是百分之一百的。我认为CST的抗体成功率是目前最高的2、表达量的多少可以看看文献3、CST说明书用的是什么细胞作为抗原呢？如果你手上有可以做个验证。看是否你做的细胞表达少

1 回答2210 围观

问新手求解答

我是金博士

1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上说，内参事必须做的。

1 回答637 围观

问Western 经常出现白板，连内参都不出来？

我是金博士

缓冲液的pH值，注意调教一下pH计

1 回答1487 围观

问血液标本怎么保存？

toadlong

一般看你干什么，一般如果用血液的DNA或者使RNA，最好直接提完之后-80保存，其他情况也直接-80保存，避免反复冻融

1 回答1577 围观

问如何选用合适的分离胶？

cardiobalon

12%的分离胶没问题

1 回答2088 围观

问为什么用四氯萘酚和 DAB 结合显色后，出现非常多的非特异性条带，而且背景显色一片？

我是金博士

1、直接DAB显色不行吗？2、二抗好像效果不好哦3、先直接用DAB试试，另外确认二抗没有带出来非特异性条带

1 回答2874 围观

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