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问
做 IP 的抗体为什么会在 WB 中显现出 IgG 条带?
wyf-525
加入的A蛋白抗体和IgG 抗体,在最后一步的煮样中,被β巯基乙醇破坏了结构,变成了重链和轻链,随后由于A蛋白抗体和你的B蛋白抗体种属来源相同,又被你的B蛋白抗体识别出来,所以显影就出现了条带。
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问
如何让分离胶面平整 ?
名闻天下
可能你的胶槽不平,第二你的压胶的液体太少,至少1ml,第三,你必须要等胶干了才能晃动胶槽,夏天至少30min,冬天更久50min,我一般加的纯水好像没什么事。。
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问
我的WB条带出现在它不应该出现的地方怎么办?
赵栋2012
qingshi战友回答:我想你可以从几下方面考虑:1. 从组织中提取的蛋白春不纯,用什么方法抽提,抽提完了后,PAGE的结果怎么样?2. 如果PAGE结果明显,而WESTERN无信号,你应该考虑两点:60KD左右的物质可能是什么,抽提过程中自带的,还是il-6形成DIMER?第二复核你用的抗体3. 一定要跑变性不连续电泳,CHECK你用的LOADING BUFFER。4. 换用标准品的IL-6,作
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问
跑WB的内参,只有一个孔没有条带,但是其余的孔都有条带,而且上样量是50ug,怎么回事?
你过de好吗
我的也是,不过我是最后一个孔内参条带没有,跑两次都这样
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问
western blot中,如何运用凝胶成像系统照相?加完二抗用TBST洗之后该做什么准备?不想用胶片显影了
dxy_9qshwa77
请问那个bio-rad成像系统怎么拍这个照片呢?
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问
稳定株real-time PCR检测表达升高1000倍 WB检测蛋白没有明显变化是为什么?
hl16010921
mRNA的量和蛋白表达量不是线性相关的,有时甚至不是正相关的(特别是抑制核糖体的调控因素时常常如此)。WB反应的是蛋白表达情况,mRNA上升1000倍,但细胞不可能将所有的核糖体都用于翻译这个蛋白,另外细胞膜的空间能容纳1000倍的该蛋白吗(细胞膜本身就镶嵌了大量蛋白,细胞大小不变,膜的表面积也就不变)。还有你看看是否可以用该蛋白敲除的细胞作空白对照,现在无法排除质粒本身会影响该蛋白的內源性表达。
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问
请教有关TSC2蛋白的转膜条件是什么?
天王盖地虎-0
Tuberin 我们也在做,或许可以把你的样本给我试试我手里的抗体
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问
做分子量270的蛋白电泳和转膜什么条件比较合适?
龟龟的花裤子
你好,我们跑的蛋白是220的 跑不出来 你的电泳和转膜的时间都是多少啊
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问
检测膜蛋白与另一蛋白相互作用,膜蛋白不表达?怎么解决?
dxymuchong
可以外转膜蛋白基因,再做co-IP啊,或者也可以做做IF(免疫荧光)看是否有共定位
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问
western blot 实验中组织提取蛋白最小量是多少?
勇者无疆2011
这个要看你的目的蛋白在你的这个标本--肺动脉里面表达的量的多少了,如果太少了,那估计是不行哦,但表达丰度较高,那肯定可以了。
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问
WB的内参一直做不齐是什么原因?
张振1986
你的这个问题是非常常见的,就算在实验室专业做WESTERN的人员,也会遇到内参不齐的问题。单独上样可以出现,可以排除蛋白本身的问题,但混合一起加时却跑的不齐,最大的可能就是胶的问题,胶配的不均匀导致蛋白跑的不在同一水平。在就是抗体孵育问题,不知你是用孵育盒,还是用封膜孵育,一定要保证膜与抗体充分接触,保证孵育效果。三是显影剂是预混还是混合好的,注意混合比例,祝楼主早日跑出理想的条带。
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问
刚买回来的抗体,如何对它的质量好坏进行评价?
caiyunmm
哦哦,一般都做什么重复验证实验啊。。有文献推荐么。。
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问
转膜内参不是很清楚该怎么办?
糖guo
也可以考虑放两张膜来转
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问
大鼠肠粘膜组织的蛋白(例:occludin)如何提取?现在用的凯基全蛋白提取液G250,用哪种loading buffer?
Sherlock4ZFB
你好,我想问一下你做的肠粘膜组织是怎么提的?直接划下来吗?还是有其它的方法,能否告知一下?
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问
RIPA 裂解细胞过程中体积逐渐变少怎么办?
zhangshm2005
加完裂解液就用刮刀刮下来吸到EP管里再放置在冰上,不要先放置再刮,不然就容易干
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问
请问负二十度冰箱过夜存放的蛋白可以做co-ip吗?
dxy_m8i2olu4
这不会破坏蛋白间的相互作用吗
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问
电泳,有时抛出两条条带,有时是一条条带,两条条带分子量相差不大,可能是什么原因造成的?
hl16010921
1.电泳的原因,相差不大的蛋白有时没有分开。染色,脱色未到最佳等。就是两条带没分开,或丢失一条。2.样品原因。部分降解,修饰(磷酸化,乙酰化等),相近蛋白的干扰。3.样品原因的话,某一样品结果是不可逆的,一条带变两条,而后该样品一直是两条带。电泳的问题是随机的,忽而一条,忽而两条。4.电泳,问题可能大。稳定电泳条件,特别是防止局部过热。
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问
RT-PCR 特异性,实验组和阳性及阴性对照组最后都出现了目的条带是为什么?
hl16010921
1.人或哺乳动物的保守基因可能是操作者带来的污染。(这点很容易被忽视,尤其是老手)2.多样品时加样失误,用排管或板时有时出现。3.试剂或水的污染尤其是公共试剂。4.电泳点样或上样时混入。5.误将引物二聚体当做目的带了(目的带低于100bp时或目的带没出,无marker时可能性大)6.都换新的重做。同时PCR时一定带手套,做实验前拖地,清洁台面,把头发,胡子包一下,不要有人员走来走去。
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问
请问, 200kD的蛋白的转膜条件是什么?
小太爷1988
100V 2小时足够了,转膜液70%水,20%甲醇,10%10x转膜液(电转液),至于恒压与恒流哪个好,因人而异吧,各有各的喜好,恒流产热比较少,我习惯恒压转,但是因为电流会随着转膜时间的增长会加大,所以产热会多一些,不过一般没什么问题,把转膜的盒子包在冰里就好,或者有条件觉得话,放在冷室里就行,一般问题不大;如果你想恒流的话250mA2.5小时-3小时应该就可以了。至于小分子的,看你的目的蛋白有
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问
蛋白没有表达是啥原因?
大爱蒙奇奇
蛋白不表达可能有很多方面的原因:1:质粒是否成功转化到你的宿主菌。2:改变诱导时机和诱导剂浓度,一般当OD值在0.5-0.6时较好。3:也许蛋白已经表达,只是不是已可溶形式表达的。4:也许是蛋白表达过低,SDS-PAGE不能发现。5:你用的菌错了,要用BL21(DE3).PET22b也的用这个菌。具体的你还得分析,我也不是很了解。
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