稳定株real-time PCR检测表达升高1000倍 WB检测蛋白没有明显变化是为什么？

相关实验：蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)

dengchch

2013-08-22

最近开始一个gene功能的新课题，建立了过表达的稳定株，准备做功能。首先用real-time PCR和WB进行验证，发现过表达稳定株相对于空载体mRNA升高了至少1000倍，但WB检测蛋白只有很少的上升。蛋白是一个跨膜蛋白，载体是pBABE。抗体正常，因为在细胞系中已验证有作用。感觉蛋白只有少量的上升，不足以引起功能上的明显变化。现在这种情况，不知道是什么原因，都不能往下做实验了。所以想请教一下大家，对于这种情况，有什么合理的解释。

3 个回答

远航TAJI

2019-06-06

有帮助

qPCR结果达一千倍不合理，结果不可用，可能是假阳性。

hl16010921

2013-08-29

有帮助

mRNA的量和蛋白表达量不是线性相关的，有时甚至不是正相关的（特别是抑制核糖体的调控因素时常常如此）。WB反应的是蛋白表达情况，mRNA上升1000倍，但细胞不可能将所有的核糖体都用于翻译这个蛋白，另外细胞膜的空间能容纳1000倍的该蛋白吗（细胞膜本身就镶嵌了大量蛋白，细胞大小不变,膜的表面积也就不变）。还有你看看是否可以用该蛋白敲除的细胞作空白对照，现在无法排除质粒本身会影响该蛋白的內源性表达。但总的来说WB有上调就是好消息。建议找个该蛋白不表达的细胞系作空白或阴性对照。