实验问答22,700,230 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问做 WB，一抗和 marker 怎样选取？

xzmcjxj

个人觉得一抗的话是abcam，cell signaling technology,santa cruz,bioworld这几家公司的不错，也比较常用，购买一抗的时候要注意它的试用范围，比如说使用的物种，主要就是H\M\R，指的是人、小鼠和大鼠，还有就是它适合做哪些实验，最常规的就是WB\IF\IMH等。而marker的话就是要根据自己的目的蛋白的大小来决定了，一般选接近的，如果分子量比较小的话就

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问做免疫沉降能否使用不同公司生产的抗体？

changhao6787

能不能做IP要看抗体说明书，有适用范围；磷酸化和非磷酸化MW差不了这么多，基本是一致的，你可以看看sigma是不是对于截短的蛋白跑wb的，具体你目标蛋白的分子量（MW）你可以在NCBI上或是文献途径确定一下，没有要求鼻血用一种公司的抗体进行试验。

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问请问如何提取 IgAN 患者血清中的免疫复合物？

云天昊

离子交换层析法提取IgG　　常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素，以QAE-Sephadex最为理想，DE22、32、52也可应用。取QAE-SephadexA25或A50经酸处理并在0.05mol/LpH7.5～8.6的磷酸盐缓冲液中平衡，将水分抽干，称湿重Ig加于10ml血清中，在室温30min后，离心或过滤除去离子交换剂。上清液再如此处理一次，即获得较纯的IgG。

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问请问性价比较高的蛋白裂解液推荐什么品牌？

萧莣苼

蛋白裂解液，现在差异不会太大，进口有CST，abcam等等，国产有碧云天，生工，百奇生物等等，不同蛋白裂解液可能不一样。

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问血液保存

twoicedragon

将全血离心后取血清-80度保存,全血冻存的话，红细胞会裂解，血清会被红细胞液污染。

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问ECL 试剂盒荧光特别弱怎么办？

hbzwwxclxq

一般ECL发光液我们实验室是在用之前从4度取出配好需要的量，然后马上放回4度冰箱，很多人是拿出来一直常温下放着等曝完光再放回冰箱，这样可能就会影响到效果哦，还有就是注意有效期吧。。。。

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问原核表达目的蛋白分子量小于GST标签蛋白是为什么？

detaibio

原核蛋白表达与纯化实验所表达的目的蛋白大多数是以包涵体的形式表现，有些蛋白可以通过降低温度，加快实验速度来改变表达情况，使蛋白表达为可溶性上清蛋白，但是最有效的还是做包涵体复性，这是比较稳妥的，可获得可溶性蛋白的方法，只是活性上会有所降低。

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问病理科的标本（肿瘤）石蜡切片，可以做western blot吗？

zq2008fish

可以的，用过西安晶彩的石蜡组织蛋白提取试剂盒提蛋白，再按常规WB实验操作，做出来效果还不错。

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问Nrf2 这个蛋白怎么做出来？

qinsiman

Nrf2蛋白存在量很少，所以要看你是否用了正确的抗体和跑胶浓度，一般用sant cruz的抗体，且上样量为30-40 ul左右

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问转膜是电流异常升高是为什么？

无情伤流水

一般是配方问题电流过大转膜会出问题

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问为什么曝光出来目的条带总是黑黑的一团，而不是一个小条带？

benjimmy33108

建议上述liona_lin的建议：降低上样量，降低一抗浓度以及调整曝光时间

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问封闭之后需要用 TBST 洗吗？

wd26persist

如果封闭液是5%的牛奶，而一抗稀释液1%de BSA的话，需要用TBST过一下

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问蛋白纯化时为什么检测不到杂蛋白？

kedaxiaoyu

穿透里检测也没有蛋白条带吗？敢问你是用什么洗脱液洗脱的，一般都是用咪唑，0.5M的咪唑柱子上的所有的蛋白基本上都就洗下来了（如果咪唑实在洗不下来的话可以用EDTA洗）……至于你所说的纯化得到目的蛋白，这个咪唑的洗脱浓度还得靠你自己去摸索。你说的是蛋白洗不下来，建议你如果是用低于0.5M的咪唑洗的话，可以考虑0-0.5M的咪唑走个短点的线性梯度，可以大概看下目的蛋白洗脱的大致咪唑浓度。

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问蛋白质免疫印迹一1抗2抗用什么稀释更好？

蜻蜓美女

1，我们实验室是用牛奶加TTBS稀释的，但是磷酸化的抗体一般是BSA加TTBS，效果很好。2，我们实验室是用水。希望对你有帮助

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问为什么 DAB 显色实验的条带弄干后总是白色？

200210lee

浓度过高，过曝了。建议降低样品，一抗，二抗浓度。

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问实验设计中的问题：提取膜蛋白（受体蛋白）后做western好出结果么？

尼克酰胺腺嘌呤二

无论是提取过程还是WB过程都需要做仔细一些，可以用一些好的产品。

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问WB转膜曝光后少样本是为什么？

phhcrab

你是用传统胶片曝光的还是化学发光成像？每次都出不来的是同一个泳道的吗？如果每次都是固定的位置出不来，是不是可以检查一下实验硬件？

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问兔子试验为什么血液离心后呈淡红色？

wxdfrank

可能是溶血了。用空针采血后，不要直接把针头插入真空抗凝管中放血，这样容易导致红细胞破裂。应该吧针头取下，揭开真空抗凝采血管的盖子后，慢慢将注射器中的血液打入抗凝管中，可以避免。或者改用真空采血管专用的采血针。

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问wentern blot抗体孵育，PVDF膜上是否可以同时孵育不同种属来源的两种蛋白？

应用场景

即使是相同分子量蛋白，用li-cor odyssey的两个近红外荧光通道也可以同时孵育不同种属一抗，二抗，同时扫描曝光，类实验常见于磷酸化蛋白检测。

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问求高手指点 WB 曝光为什么出现反影？

lostree5544

最简单的方法就是换下试剂，之前我们也是遇到了麻烦，百思不得其解，老板给的意见，结果就这么出结果了.请问你片子是机器洗出来的，还是手工的呢？

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