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        求高手指点 WB 曝光为什么出现反影?

        相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

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        三鱼儿

        我做的分子在 35-45 之间,一抗 1:5000,3%milk,二抗1:12000,封闭室温 1h,5%milk,结果整张膜都是黑的,之前试了几个一抗条件也是如此。看有人用复方配一抗,于是改进:一抗1:5000,3%milk+0.4%gelatin,室温封闭 2h,结果其中一个因子整张膜都是黑的,但是目的条带的地方却是亮的,就是跟该有的结果是反过来的,这是不是叫反影?另外,另一个分子,背景不那么深,但是也同样出现反影。我们抗体是 Abcam 的,按理来说应该是很好的抗体。请问,有人出现这种情况吗?该怎样改进?还有,有人用 gelatin 封闭过吗?浓度是多少,用什么配的啊?求高人指点,大家给个建议。
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        5 个回答

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        陈志从斌

        有帮助
        是一抗的问题,但是一抗是一个体系,包括一抗和一抗稀释液,原因:一抗浓度低;稀释液有问题间接导致一抗浓度过低或活性减弱。
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        snowyca

        有帮助
        换一下染色的膜。。。我之前用PVDF膜也出现这种情况,后来用NC膜就好了,原因可能是PVDF膜本身背景过高
        user-title

        三鱼儿

        有帮助
        首先感谢你们的建议。这个跟曝光时间没关系,因为一进入暗室整张膜都是荧光,很强。二抗是用5%milk稀释的。;我这是自己弄得片子,实在不行,我也打算下学期换其他公司的试剂了。
        user-title

        我是金博士

        有帮助
        如果手工的话,建议曝光时间短一点吧!怎么二抗后面还有5%milk?
        user-title

        lostree5544

        有帮助
        最简单的方法就是换下试剂,之前我们也是遇到了麻烦,百思不得其解,老板给的意见,结果就这么出结果了.请问你片子是机器洗出来的,还是手工的呢?
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