蛋白纯化时为什么检测不到杂蛋白？
honeywanghe
您好！我做HIS标签的蛋白纯化，但是在过NI柱时出现各洗脱组份都检测不到蛋白条带的现象，即使是杂带也没有，试着加大洗脱液浓度、增加洗脱梯度，可是结果依然如此，后来检测柱子填料时发现目的蛋白还在填料里挂着 。但就是洗脱不下来 ，请问为什么检测不到杂蛋白呢？有什么方法可以解决这个问题，得到纯化的目的蛋白吗？
4 个回答
Beat16
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建议重新装柱，使用新的填料尝试一下，一般300mM的咪唑基本可以把目的蛋白洗下来，前提是先用低浓度的咪唑洗去杂蛋白。还有就是最好在平衡柱子的时候在缓冲液里加入低浓度的咪唑，一般10mM即可，有利于蛋白挂柱。
detaibio
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重组蛋白纯化挂柱无法洗脱通常有以下几个原因：
1. 如果N-和C-同时带有组氨酸标签，会使洗脱的咪唑浓度增加
2.蛋白本身的PI过高也会增加洗脱难度
3.洗脱缓冲液的pH过高
4.纯化过程中蛋白变性沉淀
cpu2004
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换咪唑，并确定缓冲液本身的成分和pH，可能你的某个试剂出现了问题
kedaxiaoyu
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穿透里检测也没有蛋白条带吗？敢问你是用什么洗脱液洗脱的，一般都是用咪唑，0.5M的咪唑柱子上的所有的蛋白基本上都就洗下来了（如果咪唑实在洗不下来的话可以用EDTA洗）……至于你所说的纯化得到目的蛋白，这个咪唑的洗脱浓度还得靠你自己去摸索。你说的是蛋白洗不下来，建议你如果是用低于0.5M的咪唑洗的话，可以考虑0-0.5M的咪唑走个短点的线性梯度，可以大概看下目的蛋白洗脱的大致咪唑浓度。
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