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asc寡聚化实验总是有问题😭
bamboopiggy
将沉淀重悬于 50 μl CHAPS 缓冲液中,其中含有 4 mM 辛二酸二琥珀酰亚胺(溶解在 DMSO 中)。在室温下孵育 30 分钟以交联蛋白质。在 4 °C 下以 5,000 x g 离心 8 分钟,弃去上清液并将沉淀重悬于 30 μl 的 2x 蛋白上样缓冲液中。在 95°C 下加热样品 2 分钟。应该就可以
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问
wb条带特别细是什么原因?tlr4 肠蛋白1:1000
dxy_gwrp7ndq
你的问题是没有选对合适浓度的胶,一般使用的胶浓度为6%,8%,10%,12%和15%的胶,而不同浓度的胶对蛋白和指示剂的压缩效果不同,浓度越高,压缩的效果越好,指示剂和显影得到的目的蛋白的条带就越细;而胶的浓度越低,指示剂和蛋白就能跑的越分散,看起来就相对粗一点。
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问
预染marker是怎么操作的呀?请问
biotides001
各厂家都有说明书,可以参照说明书或者问师兄师姐
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问
蛋白总是发成这样,为啥呢?
bqejjh123
可能是因为你的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的杂质含量太高了
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问
为什么CO-IP实验后的IgG显影明显?
刹那芳华2333
发生了非特异性结合,可以换一下igG
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问
SDS-PAGE跑胶这个是缓冲液的问题吗?
bqejjh123
要么胶的浓度有问题,不同浓度的胶适用的分子量大小不太一样,自己查查,要么电泳缓冲液有问题,重新配新的,还有点样量少一些。跑的时间在长点。祝顺利
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问
coip的IgG组一定要一点都看不到吗?实验组比IgG组深很多可以吗?
刹那芳华2333
最好是看不到,要不然没有说服力
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问
大家做coip实验IgG加多少ul啊?应该跟抗体加一样量吗?
天一湖医者
通常上样量为50ug/100ug。
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问
wb条带整个泳道都是黑的
bqejjh123
可能:1.凝胶不均匀冷却,中间冷却不好; 电泳系统温度偏高,这样容易形成混乱一片。2.可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全,也容易混乱。3.样品溶解不好。4.样品中含有不溶性颗粒。5.加样量过多。
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问
WB曝光后,膜一片白一片黑而且条带很浅是怎么回事?
bamboopiggy
估计是你的抗体不特异,所以条带浅,然后与黑的地方有非特异性结合。你可以试试增加抗体浓度,看条带会不会黑点。至于非特异性结合,你在确定条带可以以后,提高点洗膜液中tween的浓度就好
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问
目的蛋白15KD左右,一直没跑出来,内参β-actin一直都有,转膜试过衡流220 40min,也试过20V 15min
小熊纯一郎
百分之15的胶,不用跑到底,15的条带位置分开就行,转膜用0.22微米的膜,转40分钟左右,跑胶时可以把那个机器泡冰水里,降低电泳液温度,转膜时转膜液预冷。增加蛋白上样量,增加一抗浓度,或者换别的品牌的一抗。我觉得主要问题在于一抗,我们实验室0.45的膜,0.22的膜,pvdf膜,nc膜,还有转膜时间少到40min或者多到2小时,是都可以将小分子跑出来的。我的第一建议是换一抗,或者加一抗浓度。
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问
跑胶的时候选择恒压还是恒流?
未来9
跑胶时要求是恒压,转膜时才是恒流
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问
请问电泳时为什么会跑成这样,谢谢
飞天幻雪
胶配的有问题。正常情况下不会出现弥散这么严重的,如果还是这样建议所有试剂都用新的
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问
请问链霉菌中做Coip如何保证蛋白活力?
bamboopiggy
做好预实验,尤其是破菌壁时注意低温。可以先按照梯度条件裂了菌,跑个wb看看,然后再进一步做ip
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问
取组织样品做WB需要灌流吗??
未来9
需不需要什么灌流是根据你们实验安排吧 和做WB没关系
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问
WB重复不出相同结果是怎么回事?
未来9
问题出在每一步都有一定的可能性,比如电泳,转膜,敷抗体,显色等等。但据我所知,WB 最关键的还是转膜和敷抗体步骤,可能是你敷抗体的时候敷的不均匀。
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问
在做印迹实验多次出现信号低的情况怎么解决?
未来9
可能的原因及建议:①你所检测的样本中不表达目的蛋白,选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性,同时查阅文献。②检测样本低表达目的蛋白,提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。③转移不完全或过转移,可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。④抗体不能识别测试种属的相关蛋白,购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交
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问
做wb实验时怎么保证蛋白不被降解
未来9
1、样本制备过程中尽量保持低温,避免蛋白变性、降解;2、加入PMSF,抑制蛋白酶活性;
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问
wb实验,一抗二抗怎么选择节约成本,还能得到好的实验结果?
bamboopiggy
一抗可以选大公司的,然后买一抗稀释液,因为里面一般带着防腐剂,可以多用几次。二抗,随便哪个公司都可以。也用一抗稀释液来配就好。
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问
we实验的时候,内参没出来,但是其他条带都很正常,而且符合结果,这样的结果是什么原因?可以用么?
dxy_91s7x0o6
内参一抗失效或二抗与内参一抗不匹配
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