实验问答21,957,306 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问WB跑不出来内参蛋白怎么办

dxy_gwrp7ndq

检查封闭剂浓度是否使用正确，一般3%脱脂奶即可；重新稀释一抗，并降低二抗使用浓度；也可以通过发光Western marker来监控整个wb过程的正确性，如果发光western marker信号同样背景很重，基本判断应该是抗体孵育、洗涤步骤有问题，试剂要逐一排查。

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问电转液需要加多少甲醇？

lijUn5895

标准的湿转缓冲液和电泳缓冲液一样，为不含SDS 的1X Tris-gly 缓冲液，加入甲醇至终浓度20%。如果转膜的蛋白分子量大于80kDa，则推荐加入SDS 使之终浓度为0.1%。

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问蛋白质溶液-20℃保存一段时间溶解后出现混浊

dxy_gwrp7ndq

长期保存可放-20C，但前提是添加50％甘油或冻干，否则冻融也会导致蛋白失活！

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问做细胞的过表达时，片段设计的最佳长度是多少？

bamboopiggy

这个取决于你的实验目的，看你要过表达的蛋白有多长啊，如果你问的是primer的长度，那至少要保证有15个以上的片段加酶切位点，加保护碱基，大概有25-30bp吧

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问酵母双杂的菌为什么在四缺板子上生长会变红，在四缺上划线有菌落生成但是是偏红那算互作吗

小京20

楼主，答案找到了吗？我也遇到了同样的问题，期待答疑。

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问跑蛋白配的一抗和二抗最多用几次？

bamboopiggy

看你用什么配的抗体，如果是牛奶，用2-3次吧，买个一抗稀释液可能会好一些。至于tlr4，你先看你抗体说明书上在什么位置吧，一般预测条带和实际条带会有差距

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问请问大家，P62跑出来总是2条带是因为降解了吗，其中有个样本内参有但所有目的蛋白都没有

bamboopiggy

5号蛋白大概率降解了。p62你两条带的趋势一致，问题不大，可以用

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问为什么重组载体会出现多了一段His标签的情况

Topmicro

应该是你设计引物的时候认为添加的his-tag，建议你查一下原始试验记录看看。

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问原核表达蛋白，出现条带大小不对怎么办？

未来9

通常就是以下两个原因的:一是蛋白本身有问题，另一个就是在实验过程中降解了

3 回答1623 围观

问各位老师跑cleaved caspase3是怎么跑的呀，为啥我跑了3次都是白板？

dxy_gwrp7ndq

可能是你分离胶的浓度不对，有预染marker的话，可以加一道预染marker。

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问Co-IP时，Input的带型不够亮，怎么解决？

天一湖医者

Co-IP时，Input的带型不够亮，可以瞬转通过表达解决。

3 回答459 围观

问请问Co-Ip如何选择合适的Input对照和同型对照？有什么要求和原则吗？

府宅

Co-IP使用Input阳性对照即可，Input即实验使用的细胞裂解液

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问检测到的条带分子质量与预测的不符?有哪几种可能的原因

小米粒e

可能基因有污染可能是非特异性扩增，引物特异性不高，退火温度不理想都会这样。

6 回答385 围观

问WB条带有点宽呢，呜呜呜

zj佐罗

是蛋白没有分开？蛋白没有分开，可以考虑延长电泳时间，或是使用更大的胶，或是做浓度梯度的胶还是蛋白拖带？蛋白拖带，考虑先纯化蛋白，用高浓度胶进行电泳，电泳槽在电泳过程中放在冰水，保持低温，转膜过程也放在冰水中进行，防止降解。希望对你有帮助。

8 回答1723 围观

问关于免疫印迹实验的相关问题

小米粒e

注意一下跑胶时候的电压以及时间，跑的时候经常看着点。转膜的时候记得缓冲液新配置

7 回答456 围观

问我做coip实验用的是碧云天的兔IgG，效果不好。请问大家用的都是什么牌子的IgG啊？

小米粒e

我用的也是santa cruz。

6 回答849 围观

问想问一下用Krytox和PFH材料制备纳米液滴，在透析除盐的时候为什么会出现沉淀呀？感觉是这些纳米液滴聚集在一起了。

lijUn5895

蛋白透析产生沉淀可能有以下原因：1.由高浓度的蛋白变性试剂(如8m尿素)，到低浓度，再到不含变性剂的buffer，如果条件变化剧烈，使得蛋白不正确折叠而沉淀，这种情况比较常见。如果选择透析的方法，一定要多加几个中间浓度梯度，而且注意低温(4度)，这有利于蛋白正确折叠。2.透析袋本身有一定的吸附，可以通过磁力搅拌来降低吸附。3.透析液PH靠近等电点，像catzp说的，换buffer。4.透析袋不干净

3 回答615 围观

问做实验需要的抗体如何制备？

天一湖医者

　抗体的制备为了研究抗体的理化性质、分子结构与功能，以及应用抗体于临床疾病的诊断、治疗及预防都需要人工制备抗体。目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体三类。一、多克隆抗体　　大多数抗原是由大分子蛋白质组成，但只是抗原上有限部位的特殊分子结构能与其相应抗体结合，称此部位为抗原决定簇（antigenic determinant）或表位(epitope)。一种天然抗原

3 回答1077 围观

问为什么co-ip空载/IgG组也有条带？

府宅

可以降低Ig抗体量，缩短了实验和对照组的时间

4 回答3649 围观

问从左到右依次为input(5ul)、IgG(10ul)、IP(10ul)组。请问大家这样的IgG可以用吗？

bamboopiggy

如果实在找不到别的IgG了，这个可以凑合用，因为你实际ip下来的东西，比igG的要多，能说明问题。

4 回答634 围观

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