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        关于免疫印迹实验的相关问题

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        学医的小龙霰

        请问各位实验室大佬们,关于Western Blot的进行过程当中,灌胶,上样都挺好的,为啥最后跑出来的条带那么不尽如人意,有这中间需要注意的情况嘛

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        7 个回答

        user-title

        小米粒e

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        注意一下跑胶时候的电压以及时间,跑的时候经常看着点。转膜的时候记得缓冲液新配置

        user-title

        zj佐罗

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        跑胶过程中,可以考虑低压低温,就是采用低电压,电泳槽放在冰水中。转膜过程也可以考虑这样处理。后续的孵育可以在低温(4度)下延长孵育时间。

        user-title

        daisy569

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        有可能样本没有处理好,我以前出现过这种情况

        user-title

        星晨风暴

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        这个跟很多因素相关,比如跑电泳时电压的大小,转膜是否充分,抗体的问题

        user-title

        Eason老歌迷

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        1.制胶:

        先制分离胶,再制浓缩胶,严格按照制胶说明书来就可以了。需要注意的一点是制胶一定要混匀!混匀!混匀!个人经验是每加一种试剂,就混匀一下,直到最后一种试剂加完。

        对于初学者,还要区分制胶的玻璃板是 1.0cm 还是 1.5cm 的,两者需要的制胶液体量是不一样的。另外,玻璃板一定要洗干净,本人平时都是用洗洁精洗干净然后用水冲洗最后用纯水冲洗,再放在烤箱里烤干并晾至室温。

        2.点样:

        点样的过程很简单,表手抖就 OK 了。再者,点样的过程一定迅速,不然前面的样容易弥散,虽说不至于太影响结果,但对于有强迫症的同学来说还是比较致命的伤害。

        3.跑胶:

        注意,跑胶时也会出现各种乌龙,如果跑了好大一会儿还不见条带下移,请看一下你的玻璃板是否放反;如果跑胶时发现温度过高,可检查一下正负极是否连接反了。跑胶建议恒压,80V 30min, 120V 60min(这个得具体看目的条带的 位置,时间可相应增减)

        4.转膜:

        请牢记转膜顺序(黑色面-滤纸-海绵-胶-膜-海绵-滤纸-白色面),如若搞不清楚,可想象一下,蛋白质是带负电荷的,应该是往正极方面跑,所以膜应该放在正极面。转膜时要恒流, 285mA—300mA 60min。特别注意的是跑胶时恒压,转膜时恒流这个条件。

        5.封闭特异性抗原:

        封闭和孵育抗体也是非常关键的步骤,封闭建议大家用 5%的脱脂奶粉, 2 个小时(或者过夜),不建议用 BSA。

        6.一抗孵育:

        封闭完以后不用洗直接孵育一抗,一抗配置溶液是 3% BSA 的 TBST(注意封闭和抗体孵育用的蛋白,封闭用牛奶,抗体孵育用 BSA,这个条件是决定条带是否齐整及有无杂带的关键),过夜(或 2 个小时)。时间上与封闭错开,如若封闭过夜,则一抗只需要两个小时。

        7.二抗孵育:

        洗三遍后孵育二抗 1 小时,洗的时间很重要,习惯是洗三遍,第一二三次分别是 5min、10min、15min。还要特别强调的是,孵育和洗膜用的转速是不一样的。孵育是低速,使膜和抗体有充分的接触时间;洗膜时要用高速,以使膜洗得干净。还有,一抗孵育时正面朝下,封闭和二抗孵育时都是朝上。(表问为什么,不知道,经验之谈)

        8.曝光:

        当满足了所有以上的实验条件之后,你就可以自信满满地去曝光了。相信我,不管是磷酸化的还是普通的蛋白,都会出现平整光滑的条带。

        user-title

        bamboopiggy

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        转膜的时候注意降温,防止胶变形。

        user-title

        未来9

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        WB的注意事项:

        蛋白质的提取

        ▶ 提取蛋白质过程中,应在低温环境下进行,以抑制蛋白酶的水解作用(可加入适合的蛋白酶抑制剂)。

        ▶ 蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存,不要反复冻融。

        ▶ 蛋白浓度低时,可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。

        提高跑胶质量的Tips

        ▶ 小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶55V,分离胶75V就能跑得很好,但是实验的时间会很长。

        ▶ 胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀(不要有气泡),玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶。

        内参的选择

        ▶ 做全细胞和细胞质的WB实验时,选择β-actin基本能满足大部分的需要。而考察细胞核样品时,由于Histone H3是染色体的组成型表达组分,表达相当稳定,并且特别好跑,可以算是细胞核内参的首选。

        ▶ 针对一些特定的内参,蛋白上样量超过一定的量时,出来的条带可能不会有显著的差别。以前看过一篇文献讲的应该是β-actin,当上样量超过20 μg时,条带灰度不会呈线性的增加。因此,在做WB校正时,调节合适的上样量也是影响实验成功较大的一个因素。

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