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问
蛋白质的毛细管电泳分析实验中,采用整个毛细管进样技术,样品可以浓缩多少倍?
Eason老歌迷
要是70%,可以浓缩差不多100倍吧。那整个的话可以浓缩130倍左右。
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问
在薄层分析等电聚焦的方法中,有哪些方法可以进行pH 梯度测定?
天一湖医者
等点聚焦电泳的测定pH梯度的方法有四种:1. 将胶条切成小块,用水浸泡后,用精密pH试纸或进口的细长pH复合电极测定pH值,然后作图。2. 用表面pH微电极直接测定胶条各部分的pH值,然后作图。3. 用一套已知不同的pI值的蛋白质作为标准,测定pH梯度的标准曲线。4. 将胶条于-70℃冰冻后切成1mm的薄片,加入0.5ml 0.01M KCl,用微电极测其pH。
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问
免疫组化和WB操作可以用同一种抗体吗
天一湖医者
如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。
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问
提取的蛋白放在冰箱-20可以反复冻融几次
dxy_amuaa0re
最好不超过5次。分装EP管减少冻融次数。
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问
WB样本扩散了,怎么办
Eason老歌迷
是不是你的上样时间太长了啊,上样一定要迅速。。你同时跑几块胶呢?既然已经扩散了,那么就赶紧调高电压,跑完看看吧,不行就在跑一次吧
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问
COIP为啥IgG组有条带
bamboopiggy
可能你的目的条带在轻链或重链附近,所以IgG对照组也有条带
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问
免疫组化和WB可以用同一种抗体吗?
天一湖医者
可以,如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。
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问
上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果?
天一湖医者
无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。
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问
我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB?
天一湖医者
1)可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜,转膜时间缩短,另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系; 2)也可以选择PSQ 膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。其他按步骤即可。
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问
一般一抗和二抗是用什么稀释的呀?
申东熙老伯
用TBST稀释,如果是用牛奶封闭的,也可以直接用牛奶稀释,因为封闭用牛奶也是用TBST配的。
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问
提取蛋白后浓度显示基本正常,但是转膜后丽春红染色看不到蛋白的位置,有marker,这是怎么回事呢?
天一湖医者
可能是转膜没转过去,或者转过了。你电转缓冲体系有问题,可以试着加点SDS,会好一点。
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问
在封闭之前膜需要漂洗吗?是用什么漂洗呀?
天一湖医者
不用洗的,封闭前后都不要洗,封闭后的更没有必要洗,因为我们的抗体就是用封闭液来配的。效果都很好!
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问
IP后的蛋白洗脱液有60ul,要跑WB的话用多少合适?
balalaLy
比如我用2个100cm皿的细胞拉的蛋白可以按照10ul左右的上样量跑,大多数蛋白都可以跑出来
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问
WB和切片灌流区别
bamboopiggy
pbs的缓冲效果很好,生理盐水也可以,有哪种,用哪种吧。但是一定注意要用冷的液体,防止蛋白降解。
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问
用bradford法定量蛋白的时候,用紫外分光光度计做线性的时候,相关系数总是做的不好,有没有相似经验的?
dxy_emzv2873
首先,实验习惯很重要,用枪的手法也是有标准的,可以去搜搜,保证稀释浓度准确。其次,样品用的什么溶剂,标准品也用什么溶剂溶解,保持一致。还有一点很重要,但是经常被忽视的:溶液里有些物质会对bradford法有影响。bradford法不受还原试剂的影响,样品中β–巯基乙醇的浓度可高达1M,DTT浓度的可高达5mM。但会收到略高浓度的去垢剂的影响,需要确保SDS低于0.01%,Triton X-100低
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问
Western Blot转膜效率低怎么办?
Eason老歌迷
你是用的半干转还是湿转,你的蛋白是多少呢?如果要是大蛋白可以试一试湿转,效果更好。你的转膜液用几次更换呢?也可以增加转膜时间试一试。
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问
WB实验显色或曝光后无条带原因在哪儿?
Eason老歌迷
可能有几个原因,一个是你的转膜没转好,或者是转膜时间太长转过了。二个是你剪膜直接把目的条带剪掉了。三可能是你孵抗体没孵好,或者是一抗二抗选错了。四可能是你的显影操作有问题
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问
Western blot实验时背景高且不均匀怎么办?
天一湖医者
封闭物用量不足,提高封闭浓度,使用适当体积保证孵育时完全覆盖。转印膜封闭物使用不当,检测生物素标记的蛋白时,不可用脱脂奶封闭。封闭的时间不够,延长封闭时间,抗体非特异性结合减少,抗体的浓度和孵育时间抗体浓度过高或洗涤不彻底,降低抗体浓度,增加洗涤时间和次数化学显色底物过多减少显色底物用量
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问
WB实验时目的蛋白信号弱怎么办?
林夕娜娜
1.加大上样量2.使用高灵敏度的发光液。
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问
westernblot配胶问题
Eason老歌迷
没啥区别,我都是用过的。之前用无水乙醇,后来该用的水。无水乙醇效果更好一丢丢
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