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科研学霸天团,48小时有问必答
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关于WB原始数据的问题
秋秋欣欣
现在也没有要求提供整张膜啊,只是需要显影的白光对照,如果整张膜的话可以混合孵育抗体
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问
跑磷酸化的蛋白总是杂带很多,该如何避免
whilt-shirt
使用5%BSA封闭,减少一抗敷育时间
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问
分子量小于10KD,western blot一直跑不出来,而且膜很扭曲
inventbiotech
分子量小的蛋白WB不好跑,一个是因为蛋白提取时容易提取不到,发生丢失。再加之跑电泳,转膜这些过程他也很容易丢失,太小了,电泳跑得快,转膜也跑得快,但是这一切都得是在提取蛋白时,提取到了这些小蛋白,建议使用不容易发生蛋白丢失的柱式法总蛋白提取技术进行蛋白的提取
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问
样品较小如何提高蛋白得率。
whilt-shirt
可以选择高通量组织研磨仪,提取率高且快速
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问
如何检测高丰度蛋白中的低丰度蛋白
李金喜
LC/MSn分析为鉴定复杂混合物中的蛋白质提供了强有力的手段。安捷伦的蛋白质组学解决方案(内流蛋白组学解决方案(Nanoflow Proteomics Solution))将先进的纳流HPLC和离子阱MSn完美地结合以来,开创了分离和鉴定低浓度蛋白质的快速解决方案。
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问
蛋白质实验中选择抗体问题
秋秋欣欣
一抗建议选择兔源的好一些,稳定一些,二抗就根据一抗选就行
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问
WB计算出蛋白样品浓度后操作原理是什么?
inventbiotech
需要等蛋白量等体积上样,这样可以让跑出来的条带均一美观,后期蛋白量比较也更容易
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问
请问,WB中转膜设备是制冰机的冰来进行降温合适还是直接放冰箱冷藏合适,放冰箱会不会温度太高导致转膜效果不好?
秋秋欣欣
用制冰器的冰来降温就可以了,这样温度更低,还可以在转膜器里放冰袋
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问
请问,细胞ELISA中空白细胞本地比实验组OD还好是为什么,OD一般控制范围在多少合适呐?
Eason老歌迷
正常情况是样品OD值和空白孔OD值都比较低,样品OD值略低于空白孔OD值。一般od值控制在2左右
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问
如何消除颜色对蛋白浓度结果的影响?
天一湖医者
用三路甲烷或乙醚萃取试试。或者稀释样品后做,去色素,过柱就可以了
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问
提完蛋白之后跑聚丙烯酰胺凝胶电泳如何看蛋白质量如何
whilt-shirt
可以试试用考马斯亮蓝染一下试试
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问
wb呈现的结果电泳跑道很明显是为什么。
inventbiotech
样品上样前离心去除杂质,,上样量要控制一下,基本可以解决这个问题
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问
组织样本Wb内参跑不出来
天一湖医者
可能是因为一抗浓度过低吧,可以试试用1:500的一抗浓度,二抗用的1:2000试试看
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问
请问大佬们,条带突然有很大的黑点是啥情况呀
balalaLy
转膜液脏了,或者封闭液没有溶解好,洗膜的时候可以洗久一点或者换多两次洗膜液
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问
想问一下跑出来的GAPDH背景很黑,会不会跟蛋白提取有关?
秋秋欣欣
背景黑的话应该不是跟蛋白提取有关,应该跟封闭或者抗体的问题
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问
WB背景很脏怎么办?
申东熙老伯
封闭久一点,可以用牛奶4℃封闭过夜,降低一抗浓度。
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问
如何选择合适的分子伴侣
Eason老歌迷
我认为需要根据你要表达的真核蛋白的特性去选择相应的分子伴侣。常用的分子伴侣有Trx、GST、DsbA等,它们使得许多外源基因能在E.coli里正确折叠,如IL—11、IGFBP-3、INF、 Insulin甚至包括结构复杂的tPA等均可获得正确折叠的重组可溶性活性蛋白。
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问
准备跑WB的蛋白煮过以后冻了3个月-20℃,再次拿来跑上样量需要多加吗?蛋白浓度会变化吗?
秋秋欣欣
-20三个月的话蛋白可能会有些降解了,大概20-30ug上样量先跑看看
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问
WB蛋白裂解问题提问
汤姆卜丽波
我们用的也是这种。一般不会补加。可以不加
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问
常规35-200之间的蛋白,应该用0.45还是用0.2um的转膜纸(pvdf)呢
whilt-shirt
0.45um的就可以,如果是小于10kd的蛋白那就要0.22um的
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