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问
如何检测高丰度蛋白中的低丰度蛋白
李金喜
LC/MSn分析为鉴定复杂混合物中的蛋白质提供了强有力的手段。安捷伦的蛋白质组学解决方案(内流蛋白组学解决方案(Nanoflow Proteomics Solution))将先进的纳流HPLC和离子阱MSn完美地结合以来,开创了分离和鉴定低浓度蛋白质的快速解决方案。
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问
蛋白质实验中选择抗体问题
秋秋欣欣
一抗建议选择兔源的好一些,稳定一些,二抗就根据一抗选就行
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问
WB计算出蛋白样品浓度后操作原理是什么?
inventbiotech
需要等蛋白量等体积上样,这样可以让跑出来的条带均一美观,后期蛋白量比较也更容易
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问
请问,WB中转膜设备是制冰机的冰来进行降温合适还是直接放冰箱冷藏合适,放冰箱会不会温度太高导致转膜效果不好?
秋秋欣欣
用制冰器的冰来降温就可以了,这样温度更低,还可以在转膜器里放冰袋
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问
请问,细胞ELISA中空白细胞本地比实验组OD还好是为什么,OD一般控制范围在多少合适呐?
Eason老歌迷
正常情况是样品OD值和空白孔OD值都比较低,样品OD值略低于空白孔OD值。一般od值控制在2左右
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问
如何消除颜色对蛋白浓度结果的影响?
天一湖医者
用三路甲烷或乙醚萃取试试。或者稀释样品后做,去色素,过柱就可以了
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问
提完蛋白之后跑聚丙烯酰胺凝胶电泳如何看蛋白质量如何
whilt-shirt
可以试试用考马斯亮蓝染一下试试
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问
wb呈现的结果电泳跑道很明显是为什么。
inventbiotech
样品上样前离心去除杂质,,上样量要控制一下,基本可以解决这个问题
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问
组织样本Wb内参跑不出来
天一湖医者
可能是因为一抗浓度过低吧,可以试试用1:500的一抗浓度,二抗用的1:2000试试看
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问
请问大佬们,条带突然有很大的黑点是啥情况呀
balalaLy
转膜液脏了,或者封闭液没有溶解好,洗膜的时候可以洗久一点或者换多两次洗膜液
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问
想问一下跑出来的GAPDH背景很黑,会不会跟蛋白提取有关?
秋秋欣欣
背景黑的话应该不是跟蛋白提取有关,应该跟封闭或者抗体的问题
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问
WB背景很脏怎么办?
申东熙老伯
封闭久一点,可以用牛奶4℃封闭过夜,降低一抗浓度。
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问
如何选择合适的分子伴侣
Eason老歌迷
我认为需要根据你要表达的真核蛋白的特性去选择相应的分子伴侣。常用的分子伴侣有Trx、GST、DsbA等,它们使得许多外源基因能在E.coli里正确折叠,如IL—11、IGFBP-3、INF、 Insulin甚至包括结构复杂的tPA等均可获得正确折叠的重组可溶性活性蛋白。
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问
准备跑WB的蛋白煮过以后冻了3个月-20℃,再次拿来跑上样量需要多加吗?蛋白浓度会变化吗?
秋秋欣欣
-20三个月的话蛋白可能会有些降解了,大概20-30ug上样量先跑看看
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问
WB蛋白裂解问题提问
汤姆卜丽波
我们用的也是这种。一般不会补加。可以不加
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问
常规35-200之间的蛋白,应该用0.45还是用0.2um的转膜纸(pvdf)呢
whilt-shirt
0.45um的就可以,如果是小于10kd的蛋白那就要0.22um的
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问
胶的浓度与已知目的蛋白分子量,怎么确定用什么浓度的胶呢。。我们目前买的是固定比例的啊
太阳阳了
10%最常用,如果你跑的蛋白差距特别特别大的话也可以用梯度胶
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问
文中提到用ncbi确定蛋白是内源还是外源,外源蛋白是不是全长序列;是否是二聚体或多聚体;等,想请问有人可以分享下查的具体指引吗?
wenfengzhu
内源性蛋白或外源性蛋白要看查询结果,直接在NCBI输入要查询的蛋白名称,最好为英文,看是自身表达,同源性基因表达出的为内源性蛋白,外来异物细胞免疫或体液免疫等出现的蛋白是外源性蛋白,此外,体外培养的,或者看和宿主是否有同源异质性,所谓同源性异质性物质,指同一种属的不同物质,有为内源,无为外源。从而确定是为内源还是外源,还要看它们的氨基酸组成,以及连接氨基酸的肽键,看是否有基团的末端切除或丢失,从而
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问
内参(β-actin)出现多条带,如何判断哪条带才是actin?
Eason老歌迷
我们都是很清晰的一个条带,因为内参很好跑。你要说内参为啥多条带,如果要是让我想原因的话,我觉得很可能是loading buffer 里面的DTT可能变质了。
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问
内参总是跑不齐该怎么办?
Eason老歌迷
一个是你要确保你的上样量是一样的。然后配胶一定要混匀。还可能是你跑胶时电压设置的问题。
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