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问
最近跑western blot 最后显色marker都没有,膜上一片空白
bamboopiggy
那你的蛋白显影还有吗?如果只是marker没有,可能是ph值的问题。孵育总蛋白后marker没有,那你内参条带的marker还有吗?如果所有marker都没有,可能是marker降解了
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问
3T3-L1 细胞诱导分化
Eason老歌迷
你要是做3t3l1细胞诱导分化的话,传代时铺板需均匀,不然会导致分化不均匀,分化比例低。从添加诱导剂开始到分化结束,通常需要8天。一般第6天脂滴就出来了,剩下2天就是脂滴积聚的过程。分化效果好的话,第4天脂滴就出来了。3T3-L1细胞添加诱导剂时,手法要特别轻,尽量用枪头贴壁逐滴加入,让液体慢慢流下,这样对细胞的冲击最小,否则极容易造成细胞卷边飘起。细胞代数越多,成脂能力越弱,需要诱导的时间也就越
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问
同一张条带曝光时左右两组实验结果对称,是转膜的问题吗,应该注意什么?
Eason老歌迷
可能是转膜的原因,要注意胶是没有正反面,但是膜有正反面,而且孵抗体也要注意膜的正反面。
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问
蛋白跑胶的时候 溴酚蓝条带弥散 最近跑的一直这样 之前还好好的 请大佬们指教
whilt-shirt
有可能是胶的原因,建议重新配胶试试
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问
【外泌体WB疑问】
illusio
2mL血清血浆提取出来的外泌体数量约undefined10的8次方至9次方,可以满足WB要求。可以找找其他原因
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问
做elisa的血清稀释液过夜之后还能使用吗
balalaLy
如果是试剂盒里的就按照说明书的建议,不过血清稀释液是可以用生理盐水替代都可以
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问
PVDF膜显影总是出现竖纹,可能是什么问题?
balalaLy
胶没有配好或者蛋白样品有杂质,样品从冰箱取出加样之前加热一下
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问
蛋白免疫印记实验结果不稳定,有什么优化方案
麻黄连翘赤小豆
上样量保持一致每次步骤一致用量抗体一致如果实验出现问题,每次更改的步骤必须记录,以便对比室温尽量一致
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问
层析纯化后的腺病毒接毒不病变
Eason老歌迷
你接种病毒病变时改变血清浓度没有,我们养细胞时血清是10%,而稀释接种病毒时血清浓度是2-3%。
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问
琼脂糖凝胶电泳
illusio
可能是制胶时带入了杂质,形成了障碍物,使得条带电泳时受到阻碍无法继续电泳,从而形成扭曲。或是制胶时溶胶不完全以致琼脂糖颗粒残留,形成一些浓度较高的区域,在DNA电泳经过这些区域时,部分DNA被阻碍在这里
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问
western膜的保存 strip心得 显多个蛋白
balalaLy
我自己的习惯是保存在tbst里边,一个星期内是可以的,我课题组有个博后是把条带放吸水纸上弄干然后用保鲜膜封起来,说是以后需要补实验的话可以再拿来用,她博士阶段经常这样做,是可行的
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问
(求助)WB条带分析
麻黄连翘赤小豆
封闭没封好,都是奶粉颗粒一抗特异性不好,建议选择单克隆抗体
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问
请问我这个是什么情况,敷上一抗以后膜上目的条带的位置可以看见灰色条带,但是扫膜看不到目的条带(内参没问题)
whilt-shirt
有可能是二抗的问题,建议重试。
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问
这是我跑的ERK和p-ERK,是要加大蛋白上样量吗,还是减少?
balalaLy
蛋白量没有问题,增加点可能更好。条带有点弥散,可以用好一点的loading
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问
看文献的时候看到了很多免疫共沉淀实验的图,想向各位老师学习一下怎么看这个结果图,谢谢!
balalaLy
图1是用usp26去拉蛋白,flag有条带,说明usp26可以把flag拉下来,即二者有结合,flag是额外加上去连在catenin下游的,usp26实际上是跟catenin结合。图2是反过来用flag去拉可以把usp26拉下来,反向证明usp26与catenin有结合。
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问
组织的ELISA测定
illusio
⼀般按1:9的重量体积⽐,⽐如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加⼊蛋⽩酶抑制剂。
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问
wb样本孔白色条带 marker是黑色的
麻黄连翘赤小豆
看样子是“反影”现象,可能是信号太强,就像是照相的时候曝光过度了,建议提高一抗和二抗的稀释倍数,缩短抗体孵育时间,如果是用ECL化学发光液的话换成低敏的会改善这种现象
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问
目的蛋白表达破碎时用pbs表达在沉淀,换成buffer a蛋白又表达在上清是为什么呢
冷泉港蛋白
1.纠正下 不是蛋白表达在上清还是沉淀,是溶解,我感觉这样说更合适2.你的蛋白应该是疏水性较强,以包涵体的形式存在,简单的说就是形成了多聚体。3.用pbs溶解不了蛋白,因此在沉淀里面;用buffer a,含有变性剂或表面活性剂,破坏了蛋白之间的疏水作用,溶解了部分蛋白出来。
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问
co ip反拉拉不下来
illusio
可能是反拉的抗体不好用,也可能是两者确实有结合,只是反拉蛋白的抗原表位被复合物掩盖,可以尝试使用强度高一点的裂解液,破坏部分的空间构想,再试一次
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问
co ip反向互作做不出来怎么解决
illusio
可能是B的抗体不好用,也可能是两者确实有结合,只是B蛋白的抗原表位被复合物掩盖,可以尝试使用强度高一点的裂解液,破坏部分的空间构想,再试一次
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