设计引物时需要清楚哪里是内含子和外显子吗？

如果引物的序列恰好在内含子中，可能会导致PCR扩增失败或者扩增出错误的产物。在设计引物时，应该尽量避免选择内含子区域作为引物的靶标，以减少这种情况的发生。

在设计引物时，可以考虑使用已知的外显子序列来设计引物，或者使用计算机软件对基因组进行分析，筛选出不包含内含子的序列作为引物靶标。此外，还可以利用特殊的引物设计技术，如外显子特异性引物设计技术（Exon-primed intron-crossing，EPIC技术），在跨越内含子的同时能够引导PCR扩增特定的外显子区域。

需要注意的是，在引物的设计过程中，还需要考虑引物的特异性、互补性、长度等因素，以确保能够扩增出目标基因的特定区域，并且避免引物的交叉反应和非特异性扩增。

是的，如果以DNA为模板设计引物，要注意内含子和外显子

需要的，不可以包含太多的内含子和外显子，不燃引物设计容易失败