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        RT-PCR 没有产物是为什么?

        相关实验:逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)

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        偶然回头

        RT-PCR 灵敏度不高,在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物。不知道有哪些原因?
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        1 个回答

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        我是金博士

        有帮助
        可能原因: 1)RNA被降解建议解决方法:在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA;在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8 mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。 2)RNA中包含逆转录抑制剂建议解决方法:通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25 μg到0.4 μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。 3)多糖同RNA共沉淀建议解决方法:使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火建议解决方法:确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体.确定GSP是反义序列。 5)起始RNA量不够建议解决方法:增加RNA量。对于<50 ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1 μg到0.5 μg乙酰BSA。 6)RNA模板二级结构太多建议解决方法:将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。 7)引物或模板对残余的RNA模板敏感建议解决方法:在PCR前用RNaseH处理。 8)靶序列在分析的组织中不表达建议解决方法:尝试其他靶序列或组织 9)PCR没有起作用建议解决方法:对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤
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