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科研学霸天团，48小时有问必答

问mirna206RT-PCR 引物和内参有什么资料可参考学习？

我是金博士

请你明确问题，是miRNA RT-PCR还是miRNA real time PCR?

1 回答992 围观

问mRNA 的 realtime PCR 怎么操作？引物怎么加？

王建勇

就是逆转录的时候要用特异性RT引物，其他的合普通的realtimePCR一样的。

1 回答933 围观

问跑 PCR 时条带出来了，可 marker 没跑开是什么原因？

我是金博士

marker没跑开主要有这几个原因：marker上样量太多，胶的浓度问题，marker自身问题，跑胶时间不够。你可以换个marker或者减少上样量，多跑一下试试看。

1 回答5048 围观

问PCT 降钙素原检测为什么不选择用赛默飞 B.R.A.H.M.S？

李梦涛

因为PCT-Q是半定量的，线性很窄，不能满足临床需求。另，自动化程度很低，相比梅里埃和罗氏，需要操作人员花费更多的精力。

1 回答3528 围观

问3'RACE 的时候对 oligo（dT）长度有没有什么要求？

yong8hu

不能太短，否则杂带很多，我们常设计27-29bp,设计2-3条，退火>65度。用的试剂盒对成功与否很关键，你的mRNA也是主要因素，保证没有降解。还要考虑基因表达丰度的问题。

1 回答1410 围观

问PCR 阴性对照有条带还可以酶切么？对酶切有什么影响？

云天昊

（1）有条带是可以理解的，只要阴性条带够浅就行；至于是否能酶切，还需请大家一起讨论；个人认为可以切

1 回答2182 围观

问各位分子生物学大神们，麻烦分析一下问题可以么，非常感谢

3218 围观

问如何确定普通反转录 PCR 时 cDNA 的用量？

苏格兰白草莓

必须要保证cDNA的量要一致才有可比性，所以最好还是做RT-qPCR。之所以要做内参，一是利用△△C法运算得到基因差异，二就是利用内参可看得出你每孔的cDNA模板量是否具有一致性，一般来说，我们实验要求样品内参的Ct值最好相差不要超过0.2~0.5，还有值得注意的是，如果内参Ct值出现过大或者过小都会影响到你的实验数据分析，一般来说内参在Ct值=12~15的位置左右为宜

4 回答2365 围观

问q-PCR有非特异性条带有没有办法在设计引物的时候提高特异性？

健坤免疫组化

现在常用的引物有染料法（sybr green 1）和探针法（taq man探针），taq man探针的特异性非常，但是价格要贵一些，而sybr green 1价格比较便宜，但是会有非特异性扩增，建议试试taq man探针，详细还可参考：http://www.biomart.cn/infosupply/27646868.htm

8 回答2876 围观

问做转基因鼠鉴定，内参跑出三条带亮度差不多而最后一条带亮度很高，可能是什么原因？

alaling

1.内参抗体质量有问题，不知其他人用起来什么样的。2.内参发光很强，曝光时胶片有移动也会出现你说的情况。3.转膜的时候胶有移位（可能性很小）。

4 回答1444 围观

问通用引物 ITS4 扩增植物 DNA，为什么一直扩增不出来？

986 围观

问能够扩出目的条带但是特别弱是为什么呀？

601 围观

问RNA 如何在提取过成中如何避免降解？

论文菌

用过柱法提取RNA比较好

1 回答1366 围观

问巢式PCR筛查某种病毒两次结果不一致，该怎么办？

我是金博士

重复性不好，就说明实验失败了。重复地出来才行。PCR能出现问题的地方太多了，你感觉你都注意到了，可能有些地方是错觉。我的建议是，看看做成功的人是怎么操作的，这个主要是用来检查你个人的操作习惯。另外，做好对照，一步步排查。引物啊，模板啊，PCR条件等都会有影响。

1 回答1630 围观

问在做PCR的引物设计时添加酶切位点应该考虑哪些问题？

我是金博士

1、移码：这是最重要的，一定要放到具体的质粒上去看，看看你加的酶切位点，连上你的目的基因，是不是会引起移码。2、酶切位点是否好切：尽量选实验室常用的，前提是你的基因片段不能有酶切位点序列，要不然就会连基因也切碎了。3、保护碱基：针对不同的酶切位点，选择不同的碱基。一般是3个，至于具体选CG还是AT就要看你的引物Tm以及碱基含量。

1 回答1815 围观

问前引物和后引物温度Tm相差10℃这对引物还可以用吗

极客医生

当然不用啊说明GC比例不和谐啊

1 回答2752 围观

问RNA提取的时总出现双峰该怎么办？

极客医生

双峰，不知是哪种样子的双峰（左右？上下？），如果是左右可能浓度太低吧，而且不是很纯，导致230值比较高。如果是上下，emmmm，你是不是选了两个值？2）逆转录以后不用测浓度，很好奇你为什么测浓度。举个例子，你把反应完的PCR产物拿去测浓度，无论你的目的基因有没有扩增出来，NanoDrop测出来的浓度都是一样的，也就是说，测浓度是没用的，同理，反转录以后测浓度也没有用。一般是反转录前算好RNA浓度，

1 回答4239 围观

问PCR 的异常条带是为什么？

我是金博士

你是按文献的引物P的吗？首先PCR设计引物也不是太难，完全可以自己做；其次很多文献上的引物甚至基因不一定是对的，还是要根据NCBI里面的来；最后针对您的情况，可以再优化下条件PCR，还是不行的话，不要纠结，重新设计引物吧，这样快一点。

1 回答2022 围观

问能够扩出目的条带但是特别弱是为什么？

dxy_hzlavip2

我也是扩不出来，请问最后怎么解决的？

2 回答609 围观

问克隆时发生突变了怎么办？

zhongmindai

回复突变可以用定点突变（site-directed mutation） PCR，但是周期也不会短。克隆的片段不长的情况下，多挑几个去测序，里面肯定会有对的。尽量选用具有更高保真性的酶扩增。

1 回答2448 围观

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