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科研学霸天团，48小时有问必答

问粪便DNA做荧光定量PCR是否一定需要标准菌株？

helen_gu

做16s吗？可能引物设计比较困难，一般特异性不够，可能会扩出其他的菌

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问在 DNA 的退火过程中，不小心把温度搞到 45℃（要求55℃）了，怎么办？

elite_xy

毫无影响，希望你不是说退火温度设定到了45℃

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问针对EV71的VP1的特异记忆性B细胞，对记忆B细胞进行单个细胞RT-PCR，如何设计引物呢？

yuandingli

你如何获得单个B细胞的？如果是血液来源的B细胞，还要筛选吧？如果是融合的细胞，用恒定区的引物就行了。

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问荧光定量 PCR 的退火温度怎么设定？怎样摸索？

dxy_ivfir56

请问做退火温度梯度pcr是用引物跑普通pcr还是跑荧光定量pcr

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问实时定量PCR探针法和染色法的区别

常安iron

探针是特异性的，染色法是非特异性的

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问做转化后菌P时直接挑取单菌落进行PCR，有哪位大侠做成功了？

我是金博士

你是有啥问题吗？转化挑取单菌落PCR，菌落不要太多，其余就按常规PCR流程。一次性多P个几管，分别从不同的平板上挑。

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问IFN-γ 的 PCR 均不能扩出片段是为什么？

wangweishi_1986

如果引物设计的没问题的话，两个建议：1.降落PCR，2.先将引物对99℃10s，再放冰上，再加到PCR体系里，试一试

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问实验室对于抑癌基因 p53 突变的检测手段都有哪些啊？

我是金博士

检测突变最直接的是测序，蛋白表达水平下降，影响因素很多，并不能证明p53基因突变。

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问cDNA 产量的很低是什么原因啊？该怎么办？

tao0129

可能的原因：1.RNA模板质量低。2.对mRNA浓度估计过高。3. 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足。4.同位素磷32过期。5.反应体积过大，不应超过50 μl。

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问某一孔荧光信号特别强是怎么回事？

tao0129

原因：1. 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多。2.试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。3.也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染。

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问有那位高手跑过小鼠 IL-9 的定量 PCR，最近我在跑换了三个引物但仍然没跑出来该怎么办？

葫芦一笑

优化一下引物的温度或者条件，还有设计的引物要在保守区域

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问阳性克隆检测PCR问题

过客一名

要不用M13引物或你的引物A或D去测个序，看看究竟连接的片段是什么？

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问请问大家：我扩增的时候出现两个峰，是不是引物的问题？

我是金博士

不一定，也有可能是引物设计的不好，可以提高下退火温度再看看

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问RT-PCR 没有产物是为什么？

我是金博士

可能原因：1）RNA被降解建议解决方法：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8 mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。2）RNA中包含逆转录抑制剂建议解决方法：通过乙醇

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问请问标注的 primer B 和 C 一般需要多长的片段呢？

我是金博士

这个还是比较容易的，你要考虑下多设计几对引物，你可以搜索下overlap PCR引物设计注意事项，蛮多的。

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问PCR引物的设计原则是什么？

赵栋2012

1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。2. 引物长度一般在15~30碱基之间。3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。4. 引物3′端要避开密码子的第3位。5. 引物3′端不能选择A，最好选择T。6. 碱基要随机分布。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。8. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。9. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。10

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问RT-PCR出现非预期条带是怎么回事？

我是金博士

可能原因：1. 物和模板非特异性退火，建议解决方法：在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。2. GSP设计较差，建议解决方法：遵循用于扩增引物设计的同样原则。3. RNA中沾染了基因组DNA，建议解决方法：使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。

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问荧光免疫 PCR 用什么仪器获得不同颜色标记的结果？

苍狼-huahua

现在市场上的PCR仪器多种多样，各自采用获取荧光标记结果的方式大不相同。现在潮流方向是用荧光探针(带有标记基因的片段和荧光基团)参与聚合酶链反应，当荧光强度达到机器可以判读的阈值，系统的原始扩增曲线就会上扬。

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问为什么电泳没有条带，就连 marker 都跑不出来？

我是金博士

如果不是样品的问题，那就是胶的问题。有没有加DNAGreen啊

1 回答1547 围观

问PCR-RFLP实验中遇到的问题

我是金博士

有没有做过对照实验，就是新买来的内切酶，先验证他能否将该位点切开？

1 回答1776 围观

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