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        大肠杆菌同源重组基因敲除筛选失败

        相关实验:大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ Klenow 片段实验

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        QM景生

        目前做到了双抗(kan+Gm)平板筛选阳性菌株这一步,但是最后发现原本的菌株(已知的是有氨苄和卡那抗性)在这个双抗平板上也可以长得很好,所以目前筛选这一步的就陷入了僵境,所以我现在是不是只有换个抗性或者换其他的敲除方法才行了,不知道有没有同行做大肠杆菌基因敲除可以分享一下经验。谢谢!

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        2 个回答

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        在这种情况下,你可以考虑以下几个建议:

        更换抗性基因:如果你的双抗筛选方法失败,可以尝试更换抗性基因,例如使用chloramphenicol、tetracycline等抗生素进行筛选。这些抗生素与kanamycin和gentamicin不同,可能对你的敲除菌株具有更高的选择性。

        采用CRISPR/Cas9等技术:CRISPR/Cas9是一种现代分子生物学技术,可以精确剪切目标基因,并插入自定义DNA序列。通过CRISPR/Cas9技术,你可以更有效地敲除基因,从而避免筛选失败的情况。同时,该技术也具有高效和可重复的优点。

        结合其他方法进行筛选:除了双抗法和CRISPR/Cas9技术,你还可以结合其他筛选方法,例如PCR检测、序列分析、Southern blotting等。这些方法可以帮助你确定敲除成功的细胞克隆,并最大限度地避免假阳性菌落的产生。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        如果双抗都是经过验证的话下一步建议换个抗性或者换其他的敲除方法,可以提高成功率,这个时候不建议更换抗体

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