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        随即寡核苷酸引物介导

        相关实验:大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ Klenow 片段实验

        最新修订时间:

        原理

        此法是一种用以产生高放射比活、放射标记均匀分布的04八片段的切口平移方法。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  用合适的限制性内切酶消化DNA,DNA片段经电泳纯化或乙醇沉淀,用TE缓冲液重悬。
         
        2.  在冰浴中混合下列物质:

        (1)2.5 μl 0.5mmol/l  3dNTP混合液

        (2)2.5 μl  10×klenow酶缓冲液

        (3)5 μl  3000Ci/mmol[α-32P]标记dATP

        (4)1 μl  klenow片段
         
        3.  将30~100 ng DNA与随机核苷酸六聚体(1~5 μg)混合至14 μl,煮沸2~3 min,置于冰浴。
         
        4.  加入11 μl 得自步骤2的混合物,立即在室温温育2~4 h。
         
        5.  加入1 μl 0.5mol/l EDTA以终止反应,加入3 μl 10 mg/ml tRNA和100 μl TE 缓冲液。

        6.  酚抽提,移上清至一个新离心管中。
         
        7.  用层析法将未掺入的放射性前体dATP从标记DNA中去除。

        7.  取出1 μl 小份样品确定32P的掺入效率。(比活度应为108 cpm/μg)

        来源:丁香实验

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